耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌中OXA-48 家族碳青霉烯酶分子流行病学研究进展

韩仁如，胡付品

作者单位： 复旦大学附属华山医院抗生素研究所，国家卫健委临床药理重点实验室，上海 200040。

1 引言

碳青霉烯类抗生素对超广谱β 内酰胺酶（ESBL）和头孢菌素酶具有高度的稳定性，但可被碳青霉烯酶水解、灭活，随着临床治疗药物的广泛应用，产生了耐碳青霉烯类的菌株，这给临床抗感染治疗带来了严峻的挑战[1]。近年来，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（CRE）的比率增加，特别是耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）比率增加。根据2017年CHINET数据显示，2005－2017年，肺炎克雷伯菌对美罗培南和亚胺培南的耐药率分别从2.9%和3.0%上升到了24.0%和20.9%，耐药率上升幅度高达8倍[2]。CRE的激增主要是由碳青霉烯酶基因出现和播散引起[3]。

临床上常见碳青霉烯类抗生素主要有美罗培南、亚胺培南、厄他培南和多利培南等。肠杆菌科细菌对碳青霉烯类耐药的主要机制是：①产碳青霉烯酶；②产ESBL或头孢菌素酶合并外膜蛋白的缺失或变异；③碳青霉烯类抗生素的作用靶位发生改变。其中产碳青霉烯酶是最常见的耐药机制[4]。临床常见的碳青霉烯酶包括Ambler A类丝氨酸水解酶（如KPC、GES）、Ambler B类金属酶（如NDM、IMP、VIM、SIM、GIM）和Ambler D类丝氨酸水解酶（如OXA-48、OXA-23、OXA-51等）。与其他OXA家族强水解碳青霉烯类作用的苯唑西林酶不同，OXA-48型β内酰胺酶具有较弱的水解碳青霉烯类作用[5]，并且该酶及其变体目前广泛存在于肺炎克雷伯菌和其他肠杆菌科细菌中[6]。

2 流行病学特征

2001年，从土耳其伊斯坦布尔的1例泌尿系统和皮肤烧伤感染的54岁男性患者中分离出1株CRKP 11978，发现并鉴定出一种新型的具有水解碳青霉烯类作用的β内酰胺酶OXA-48[7]。随后，在世界范围内相继报道，是社区获得性和医院获得性感染暴发的主要来源之一，主要集中在中东和欧洲等地区，其他国家也有报道，如中国、美国、印度等[6]。土耳其仍然是D类酶检出率最高的国家，在最近的一项研究中，土耳其检出的CRE菌株中92%是产OXA-48型碳青霉烯酶菌株[8]。根据EuSCAPE工作组的报告，2014－2015年在西班牙、法国、比利时和罗马尼亚OXA-48的流行水平达到第4阶段或 “区域间传播”（在不同的卫生区域发生多次流行病学相关的暴发，这表明区域间的暴发在本土机构间传播）[9]。迄今为止，已经鉴定出11种OXA-48型碳青霉烯酶的变体（如OXA-232、OXA-181、OXA-162、OXA-163等），广泛存在于肺炎克雷伯菌和其他肠杆菌科细菌中[6]，并且具有显著的地域差异。2015年，四川大学华西医院首次从1例血流感染患者中分离出1株产OXA-181型碳青霉烯酶的大肠埃希菌[10]，随后2017年复旦大学附属儿科医院在新生儿中分离出产OXA-232型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌[11]，我国主要流行这两种OXA-48型碳青霉烯酶的变体。编码OXA-48家族碳青霉烯酶的基因通常位于单个质粒上，可在不同菌属的肠杆菌科细菌中传播[12]，并且能够合并其他耐药基因，表现出多重耐药的特 性。

3 分子生物学特性

OXA-48型碳青霉烯酶属于Ambler D类酶，Bush分类Ⅳ型，是质粒介导一般不被克拉维酸抑制的β内酰胺酶，对青霉素具有强水解活性，弱水解或不水解头孢菌素酶[13]。泛宿主性质粒携带blaOXA-48位于复合转座子Tn19992内，pOXA-48a（OXA-48a型质粒）序列分析表明，blaOXA-48上下游分别有一段插入序列IS19992，blaOXA-48上游有编码噬菌体复制蛋白的rep基因，下游有编码调节蛋白的lysR基因以及一个编码乙酰辅酶A羧化酶的基因片段[12]。blaOXA-48最常见于IncL/M质粒中，该质粒大小为60～70 kb，无其他耐药基因，是肠杆菌科中常见的质粒之一，通常存在于环境和临床菌株中，这可能与blaOXA-48易于播散的特性相关[14-15]。此外，有研究报道，pOXA-48a中的转移操作子与pCTX-M-3中的转移操作子非常相似，由两个不同的区域组成，这一共同特征表明，blaOXA-48在肠杆菌科细菌中的传播倾向可能与blaCTX-M-3相仿[12]。

另外，Turton等[16]报道的2株大肠埃希菌分离株染色体整合了blaOXA-48，与质粒上blaOXA-48具有相似的基因排列，其中携带blaOXA-48的质粒片段由IS1R元件整合到染色体上，但质粒片段的长度和插入位点各不相同。质粒片段来源于pOXA-48a[17]。在另一项研究中，Beyrouthy等[6]研究发现OXA-48型碳青霉烯酶遗传环境的可塑性是由IS1R插入序列介导的，插入序列可诱导OXA-48编码基因转入大肠埃希菌染色体，从而促进其低水平的持续表达。

4 耐药机制

4.1 OXA-48型碳青霉烯酶

越来越多的肠杆菌科细菌中出现D类β内酰胺酶OXA-48。OXA-48型碳青霉烯酶对碳青霉烯类具有弱水解活性，对亚胺培南的水解活性大于对美罗培南的活性，厄他培南则是这种酶作用的最佳底物[6]。此外，当编码OXA-48型酶的基因被克隆到碳青霉烯类敏感的大肠埃希菌质控菌株中时，导致对碳青霉烯类的最低抑菌浓度（MIC）适度增加（MIC从0.004～0.12 mg/L增加至0.1～0.5 mg/L）[7，18-19]。当合并膜孔蛋白缺失或变异时，OXA-48型可能表现出对碳青霉烯类的强水解活性，导致其对厄他培南耐药，对美罗培南敏感性降低，对亚胺培南敏感[20]。

4.2 OXA-48型碳青霉烯酶的变体

到目前为止，已经确定了11种类似OXA-48型碳青霉烯酶的变体，如OXA-162、OXA-163、OXA-204、OXA-244、OXA-245、OXA-247、OXA-370、OXA-405等通过一个氨基酸的替换或是4个氨基酸的缺失降低了其水解碳青霉烯类的能力[21]。这些酶对青霉素具有强水解活性，而对碳青霉烯类仅有弱水解作用，对β内酰胺酶抑制剂不敏感，不水解广谱头孢菌素。OXA-163型是一个例外，可水解广谱头孢菌素，但水解碳青霉烯类能力非常弱，并且对β内酰胺酶抑制剂敏感[18]。OXA-181和OXA-232与OXA-48型碳青霉烯酶水解抗菌药物谱相似[6]。在中国的首例报道中发现OXA-232型碳青霉烯酶合并膜孔蛋白OmpK35和OmpK36的变异，导致其对碳青霉烯类的耐药[11，20]。

4.3 产OXA-48型碳青霉烯酶及其变体菌株携带其他耐药基因

4.3.1 ESBL和AmpC基因 有研究表明，大多数产OXA-48型酶及其变体的分离株因携带CTX-M-15或CTX-M-14基因，同时携带TEM-1和/或OXA-1基因产生ESBL[22]。此外，其他研究也证实了产OXA-48型变体的肠杆菌科细菌在其他质粒上共表达ESBL和AmpC基因，包括blaTEM、blaSHV和blaCTX-M等[6]。

4.3.2 碳青霉烯酶基因 根据不同国家研究报道发现，产OXA-48型及其变体的肠杆菌科细菌中发现同时存在其他碳青霉烯酶基因，如blaNDM-1、blaNDM-5、blaNDM-7、blaKPC-2、blaVIM-1、blaVIM-5、blaIMP-1等[6]。

4.3.3 其他耐药基因 根据不同国家研究报道发现，产OXA-48型及其变体的肠杆菌科细菌中发现质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrS和氨基糖苷类耐药基因aac(6')-Ib-cr、aac(3)-II、rmA、rmtB、rmtC和rmtF等[6]。

5 检测方法

由于许多产OXA-48型肠杆菌科细菌对广谱头孢菌素没有耐药性，或者对碳青霉烯类的敏感性降低，因此对这些细菌识别和检测可能具有挑战性，需要适当的筛查和检测方法来预防和控制其传播[23]。CLSI推荐的碳青霉烯酶检测方法，如改良Hodge试验、改良灭活碳青霉烯试验（modified carbapenem inactivation method，mCIM试验）和Carba NP等试验虽然能检测出产碳青霉烯酶的菌株，却无法确定其表型，需要进一步的基因检测验证，并且对其中一些碳青霉烯酶OXA-232型和OXA-181型的检出率低，假阴性率高[24]。

5.1 表型检测方法

根据OXA-48具有水解替莫西林活性高的特点，进行相应的药敏试验，结果表明，根据替莫西林MIC值能够在产OXA-48酶的菌株和WT易感菌株以及携带ESBL/AmpC的菌株之间进行表型区分，而与其他碳青霉烯酶的区别可能需要进行基因检测[25]。

免疫色谱法（immunochromatographic tests，ICT）可以快速检测出4种最常见的碳青霉烯酶：OXA-48型、KPC型、NDM型和VIM型。具有灵敏度和特异度高、快速、易于操作等特点[26]。

5.2 分子检测方法

FDA-cleared 试验：BioFire FilmArray®（法国梅里埃公司）可以检测常见的几种KPC、VIM、IMP、NDM和OXA产碳青霉烯酶基因，灵敏度和特异度高，但是只能直接检测血培养阳性标本中的细菌种类和耐药基因，并且成本高。BD MAX™CRE（美国BD）通过其系统检测KPC、NDM和OXA-48基因的存在，该系统可在约2.5 h内自动进行样品提取、扩增和实时PCR检测，具有灵敏度和特异度高的特点[27]。CepheidXpert®Carba-R（美国赛沛）是一种基于试剂盒的定性实时PCR检测，旨在检测KPC、NDM、VIM、IMP-1和OXA-48基因，并且在48 min内提供结果。此外，该测定现在涵盖OXA-181、OXA-232和OXA-48基因及其他变体，可直接检测直肠拭子标本。Check-Points B.V.（荷兰Check-Points）提供各种检测方法，用于检测临床标本和细菌分离株中的碳青霉烯酶、ESBL和AmpC酶。Check-Direct CPE测定是一种多重实时PCR测定，其在2 h内直接从直肠拭子或集落靶向KPC、NDM、VIM和OXA-48基因，但不靶向IMP[27]。虽然分子检测方法可以快速检测碳青霉烯酶基因，但作为常规筛查来说，成本高，操作繁琐，难以广泛应用。

6 结束语

肠杆菌科细菌是临床最常见的病原体，可导致社区获得性和医院获得性感染，产OXA-48家族碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌易于播散和多重耐药的特性将会给公共健康带来威胁。而碳青霉烯类抗生素作为临床治疗革兰阴性杆菌的最后一道防线，保留碳青霉烯类药物疗效对于临床上治疗严重的革兰阴性菌感染至关重要[5]。因此，早期检测筛查定植或感染产碳青霉烯酶的菌株具有重要意义。医院需要加强院感控制，监测耐药细菌的发生率，积极采取措施控制耐药细菌的传播，以保护人类健康。