电场对体外培养软骨细胞的影响

刘小利 袁小燕

（长治医学院物理教研室，山西 长治 046000）

软骨是一种具有丰富的细胞外基质（ECM）的无血管组织，包含少量的软骨细胞，软骨细胞可保持ECM的完整性。软骨组织受到损伤后，软骨修复主要依赖于软骨细胞的增殖、分化和ECM合成。如果在常规条件下体外培养软骨细胞，由于增殖能力较低，软骨细胞在经过一定的倍增后会逐渐丧失增殖能力而停止分裂。研究表明，软骨细胞受到电刺激会影响细胞增殖，迁移和基因表达。但施加外电场时所需的电压、频率、波形等物理参数以及电场对软骨细胞的作用机制仍需进一步探讨。

1 电刺激装置

电刺激场为直流电场或交流电场，可以是脉冲或连续形式的正弦波、锯齿波或方波信号。这些信号可以由刺激芯片、信号发生器或其他仪器产生。电刺激方式为直接刺激或间接刺激。一般情况下，直接刺激是将正负电极直接插入培养皿中刺激细胞。间接刺激是以非侵入性的方式使用连接电源的外部平行电极，即在平行电极之间的培养基上施加电场，是一个电容耦合刺激系统[1]。

2 电场对软骨细胞的影响

电场在体外单层培养的软骨细胞中的应用已表明电场刺激可增加软骨细胞数量并刺激合成复合软骨的主要分子，如Ⅱ型胶原、糖胺聚糖（GAGs）和聚集蛋白聚糖。但是，促进软骨细胞增值和相关分子的基因表达，需要设置合适的电刺激参数，如刺激时长、电压、占空比和频率。

2.1 直流电场对软骨细胞的影响：有研究认为，5 µA的直流电可刺激间充质干细胞向软骨细胞分化，并增强软骨细胞的增殖[2]。直流电场还可影响软骨细胞的迁移[3]，将直流电场作用于牛关节软骨细胞，电场强度大于0.8 V/cm时软骨细胞有阴极迁移反应，当电场强度大于4 V/cm时，软骨细胞表现出剂量依赖性的阴极迁移。但是，并不是所有的研究都认为直流电场会对软骨细胞产生影响。Akanji等[4]将分离出的牛关节软骨细胞，接种于琼脂糖结构上，然后暴露在电流密度为4 mA/cm2的直流电场下6小时，结果表明，电流对蛋白质合成、细胞增殖、聚集蛋白聚糖和II型胶原mRNA表达无影响。虽然直流电场是提供电刺激的最简单方法，但是由于金属电极的生物相容性较差，在电刺激细胞过程中会导致培养基pH值的变化、分子氧水平降低等不良反应，使得这种方法的使用受到了阻碍[5]，目前应用较多的电刺激方式为电容耦合电场。

2.2 电容耦合电场对软骨细胞的影响：早在1978年就有研究发现电容耦合电场可促进鸡胫骨软骨细胞DNA合成[6]。随后，Brighton等[7]做了较详细的研究，在频率60 kHz的正弦波条件下，用不同电压刺激牛膝关节软骨细胞24 h，结果表明，10 V和1000 V的电压抑制了细胞的增殖，而250 V的电压则增加了GAGs的合成，但电场对关节软骨软骨细胞的作用机制尚不清楚。在以上的研究中，并没有指明电刺激时电场强度的大小，Armstrong和Brighton 进行了相关的研究。Armstrong[8]使用60 kHz的正弦波信号刺激牛生长板软骨细胞24 h，当电压为500、750、1000 V即电场强度为（1.5～3.0）×10-2 V/cm时，细胞增殖显著；而电压为1500 V即电场强度为4.5×10-2 V/cm时，电场则明显抑制了软骨细胞增殖。Brighton[9]用不同的电场刺激牛生长板软骨细胞，结果表明，当电场强度分别为15、22.5、30 mV/cm时，软骨细胞数量增加；当电场为45 mV/cm，刺激后GAGs合成增加66%，从而可以认为电场强度接近20 mV/cm时，电刺激可促进软骨细胞增值。在接下来的研究中进一步表明[10]，60 kHz正弦波、强度20 mV/cm的电场可使牛生长板软骨细胞增殖增加47%。Wang等[11]在更详细的研究中表明，20 mV/cm的电场在促进软骨细胞增值的同时，还可促进聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的合成，但二者所需的最佳电刺激参数（如占空比和刺激时长）并不相同，说明在不同的电刺激条件下，软骨细胞中大分子的基因表达上调具有一定的选择性。然而，并不能认为只有60 kHz、20 mV/cm的正弦波信号可促进软骨细胞增值，Vaca-González等[12]用有限元方法分析计算电刺激系统中的电场强度，结果表明，在30 min内施加4 mV/cm的电场时细胞数量增加；在5 h内施加8 mV/cm的电场可维持稳定的GAGs合成。有研究发现脉冲电场（PEF）和交变电场也可对软骨细胞产生影响。使用0.2 mV/cm的电容耦合脉冲电场刺激正常人软骨细胞，软骨细胞DNA含量在电刺激后72 h增加近150%[13]。用1 kHz，700 mV的交变电场刺激人膝关节软骨细胞，基因表达分析表明，在低氧培养条件下，电场能增加人软骨细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达；暴露于缺氧电场后，II型胶原合成显著增加[14]。

3 电场对软骨细胞的影响机制

在电场作用于软骨细胞的过程中，电信号影响软骨细胞的具体机制仍不清楚[15]，可能涉及钙信号转导通路。

Rodan等[6]认为鸡胫骨软骨细胞增殖是由于细胞膜去极化引起的，外加电场促进了软骨细胞的Na+和Ca2+流通进而触发了软骨细胞的DNA合成。而Beit-Or等[16]在测定体外培养的鸡骺软骨细胞增殖分化的实验中证实，在软骨细胞老化过程中细胞内游离Ca2+含量逐渐下降，认为Ca2+浓度升高可导致软骨细胞增殖。最早关于电压依赖性钙通道可能参与早期软骨分化的研究发表于1989年[17]，其中L型钙通道是细胞外Ca2+进入细胞的主要途径，对维持细胞形态和生理活性起着重要作用。超微结构研究证实了小鼠肢芽软骨细胞中存在L型钙通道[18]，Mancilla等[19]的研究也表明L型钙通道存在于软骨细胞中，并参与了软骨细胞的增殖和分化。然而，Sanchez等[20]发现细胞内Ca2+变化不受L型钙通道阻滞剂（包括维拉帕米）的影响。为了进一步阐明L型钙通道在软骨细胞中的作用，Xu等[21]用电容耦合的方式刺激牛髌骨关节软骨细胞，结果表明电刺激软骨细胞主要对细胞膜施加影响，通过激活细胞膜中的电压依赖性钙通道，提高细胞内Ca2+浓度，导致细胞增殖增强、聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达上调，并对下游的钙调蛋白和钙调磷酸酶产生影响。

4 结 语

对于电刺激软骨细胞，不同的研究者使用的电场频率、强度、刺激时间等参数各不相同，由于产生电场所需的电压、达到最佳增殖速率和分子合成的刺激时间以及细胞培养所需的时间等限制因素，所得到的结果存在许多差异。电刺激软骨细胞的确切作用机制也待进一步阐明。因此，软骨细胞电刺激在组织工程领域仍然需要更加深入的研究。