miR-153靶向调控GALNT7对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

徐启英，左 英，郭桂兰，任玉环，李学静

(青海大学附属医院妇科，青海 西宁 810001)

microRNA(miRNA)是一种可以结合在靶基因mRNA3′-非翻译区(3′-UTR)的小RNA分子，通过降解靶基因的mRNA或抑制其翻译来调控基因表达。现有研究表明，很多种癌症的发生和发展都与miRNA的失调有关。最近发现miR-153与很多癌症都密切相关，如乳腺癌[1]、结肠直肠癌[2]、食道癌[3]、胰腺癌[4]、胃癌[5]、非小细胞肺癌[6]、卵巢癌[7]等。因此它被当做癌症的潜在目标基因[8-10]。

已有研究显示，miR-153在宫颈癌(Cervical cancer)中可能作为一种肿瘤抑制因子，因此研究其对宫颈癌的抑癌机制有一定意义。

通过生物信息学分析发现GALNT7可能是miR-153的靶基因。GALNT7是N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族中的成员，是催化O-聚糖合成第一步的酶，O-糖基化与细胞识别，肿瘤细胞生长、转移和黏附等功能密切相关。

本研究探讨miR-153(microRNA-153)靶向调控GALNT7对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂选择

宫颈癌细胞系Hela、C-33A购于ATCC公司。RPMI-1640培养基、胎牛血清购于Gibco公司。miR-153、miR NC购于TaKaRa公司。脂质体购于ThermoFisher公司。GALNT7、GADPH抗体及HRP标记二抗购于SIGMA-ALDRICH公司。双荧光素酶检测报告系统试剂盒购于Promega公司。

1.2 miR-153对GALNT7靶向作用的验证

采用荧光素酶实验验证miR-153对GALNT7靶向的作用。将Hela、C-33A以2 ×105/孔接种于6孔板中，置于细胞培养箱中培养24 h，参照Lipo2000(ThermoFisher公司)的说明书进行细胞转染操作。转染分组：pRL-TK/pMIR-report-3′UTR/miR-153组、pRL-TK/pMIR-report-3′UTR/miR-NC组；pRL-TK/pMIR-report-3′UTRm/miR-153组、pMIR-report-3′UTRm/miR-NC组。pRL-TK质粒表达海肾荧光素酶，pMIR-report-3′UTR为表达萤火虫荧光素酶的非突变质粒载体，pMIR-report-3′UTRm是表达萤火虫荧光素酶的突变质粒载体。Hela、C-33A细胞转染48 h后，用裂解液提取蛋白，利用荧光素酶试剂盒进行操作，向孔板中依次加入LARⅡ和stop/glo，前者检测萤火虫荧光素酶活性，后者检测海肾荧光素酶活性。相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性×100%。

1.3 细胞培养和转染实验

Hela、C-33A细胞需要在37 ℃、5%CO2的条件下进行培养。用胰蛋白酶将两种细胞消化后，将其浓度调整为3×105/mL，取出1 mL接种至6孔板中，恒温(37℃)培养24 h，将接种的细胞分为三组：control、miR-NC和miR-153组，参照Lipo3000(ThermoFisher公司)的说明书进行细胞转染操作。

1.4 实时荧光定量PCR实验

将Hela、C-33A细胞分别接种于24孔(3×104/孔)中，培养24 h后，参照Lipo3000说明书进行转染操作。分为control、miR-NC、miR-153组。Hela、C-33A分别转染48 h后，将收集的细胞裂解后提取mRNA，利用反转录试剂盒进行反转录后进行实时荧光定量PCR实验。反应条件为95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s，40个循环后，进入熔解段(95℃ 15S，60℃ 30S，95℃ 15s)，反应终止。用2-ΔΔCt计算GALNT7 mRNA的相对表达量。

1.5 免疫蛋白印迹实验

收集转染48 h的细胞，用RIPA裂解液裂解，裂解的蛋白用BCA定量，进行SDS-PAGE电泳(恒流35mA、1h)。经凝胶电泳分离后，将蛋白半干转至 PVDF膜上(20V，1h)，用含5%脱脂奶粉的TBS进行封闭。用一抗(兔抗人GALNT7、兔抗人GAPDH抗体)在室温下孵育2 h、TBST洗膜(3times×5min)；用二抗(羊抗兔HRP)在室温下孵育1 h、TBST洗膜(3times×5min)，以ECL显影。使用软件测定条带灰度值。

1.6 CCK8增殖实验

两种细胞转染24、48、72 h时，分别以1×104/孔的浓度接种于96孔板中，培养24 h后，每孔中加入10 μL CCK8试剂，继续培养4 h。将细胞从培养箱取出后，用酶标仪检测各孔的OD值，每组实验重复3次。

1.7 细胞划痕实验

Hela、C-33A细胞分别接种于24孔板(3×105/孔)中，培养24 h。观察细胞，当细胞长满24孔板时，用10 μL移液器枪头进行划痕，0、24 h时进行拍照，每组实验重复3次。

1.8 细胞侵袭实验

转染48 h后，用胰酶消化Hela、C-33A细胞并计数，取1×105个细胞进行离心，用100 μL无血清培养基进行悬浮，将细胞悬浮液接种至Transwell小室中，分为control、miR-NC、miR-153组，下室中加入600 μL含血清的培养液，置于细胞培养箱进行培养。培养24 h后，用PBS洗5min，弃去PBS，用4%多聚甲醛固定30 min，再用0.1%结晶紫溶液染色，用棉签将小室的上层细胞擦掉，用显微镜观察并计数，每组实验重复3次。

1.9 统计学处理

选用Graphpad prism 7.0软件对数据进行处理，所有数据采用mean±SD，两组数据采用双样本t检验。两组以上的数据采用one way ANOVA 软件进行分析，P<0.05代表有统计学意义差异。

2 结果

2.1 miR-153靶向作用GALNT7的验证

通过生物学软件可以得出，miR-153可能靶向结合GALNT7的3′-UTR(图1A)。双荧光素酶实验结果显示，3′-UTR组中，与miR-NC相比，miR-153组荧光素酶的活力值明显降低，差异具有意义(P<0.05)。但3′-UTR结合位点突变(3′UTRm)之后，荧光素酶的活性无明显变化(图1B)，证明miR-153已靶向结合GALNT7的3′UTR。

Figure1Therelativeactivityexpressionofluciferase

2.2 miR-153对宫颈癌细胞GALNT7 mRNA和蛋白的抑制

实时荧光定量PCR结果显示，在Hela细胞中，miR-153组GALNT7的mRNA相对表达量是0.43，在C-33A细胞中，miR-153组为0.22(图2A、B)，可以看出miR-153可下调GALNT7的mRNA的表达均低于miR-NC及control组。免疫蛋白印迹实验结果显示，在Hela细胞中，miR-153组GALNT7的蛋白相对表达量是0.25，在C-33A细胞中是0.37(图2C、D)。均低于miR-NC及control组。由此可知，在宫颈癌细胞中，miR-153下调 GALNT7 mRNA和蛋白的表达，对其mRNA和蛋白的表达具有明显抑制作用，差异具有意义(P<0.05)。

Figure2ExpressionofGALNT7mRNAandproteinafterHelaAndC-33AcellstransfectedwithmiR-153

2.3 miR-153对宫颈癌细胞增殖的影响

将Hela和C-33A细胞转染miR-153 24、48、72 h时，用CCK8试剂盒分别检测其A450值并绘制生长曲线时发现，在Hela和C-33A细胞中，与control、miR-NC组相比，miR-153组的A450值明显下降，说明miR-153可抑制宫颈癌细胞的增殖能力(图3A、B )。

Figure3SchematicdiagramofcellproliferationinhibitionafterHelaandC-33AcellstransfectedwithmiR-153

2.4 miR-153对宫颈癌细胞侵袭的影响

经Transwell小室检测实验发现，在Hela中，miR-153组穿透基质胶的细胞数为261±9.08，其他两组的细胞数量分别为258±8.78、90±5.12 ，在C-33A中前者的细胞数为250±8.03，后两者分别为249±7.56、84±4.23，可以看出miR-153组穿透基质胶的细胞数量明显减少，表明miR-153对宫颈癌细胞的侵袭能力有明显抑制作用(图4A、B)，差异均具有显著意义(P<0.05)。

Figure4SchematicdiagramofcellinvasioninhibitionafterHelaandC-33AcellstransfectedwithmiR-153

2.5 miR-153对宫颈癌细胞迁移的影响

细胞长满24孔板时划痕，并在0、24 h拍照。结果显示，在Hela和C-33A中，24 h与0 h相比，miR-153组细胞间的距离明显大于其他两组(图5 A、C)，miR-153组细胞的愈合百分数下降(图5B、D)，说明转染miR-153后，细胞愈合划痕的能力明显下降，表明miR-153能够抑制宫颈癌细胞的迁移能力(P<0.05)。

Figure5SchematicdiagramofcellmigrationinhibitionafterHelaandC-33AcellstransfectedwithmiR-153

3 讨论

microRNA(miRNA)主要是通过与靶基因3′-UTR的结合导致其mRNA的降解或者抑制其基因转录从而降低靶基因的表达水平[11-14]。许多文献已经证实，miRNA在癌症的整个过程中起着很重要的作用，包括宫颈癌。虽然总体存活率随着医疗手段的进步有所提高[15]，但结果仍然不理想。因此阐明宫颈癌的分子机制对于宫颈癌患者的治疗具有重要意义。

miR-153已被证实是很多癌症的关键参与者。在胶质母细胞瘤、乳腺癌中，它是通过促进细胞凋亡来抑制肿瘤的发展。在肝癌中，它影响肝癌细胞的侵袭、迁移能力。在胃癌中，它与患者的癌细胞转移密切相关。在结肠直肠癌中也与肿瘤细胞的侵袭有关。在很多癌症中，它都是作为致癌因子或者肿瘤抑制因子发挥作用[3-10]。miR-153在宫颈癌中的作用部分已被阐明。它通过抑制细胞增殖来抑制宫颈癌的发展过程，并且miR-153与患者5年的存活率、肿瘤大小、淋巴转移等都有关。总之，miR-153通过抑制细胞增殖来抑制肿瘤的进展，且与很多不良结果之间有关联。因此，miR-153对宫颈癌的发生、发展起着重要作用。但尚无关于宫颈癌中miR-153靶基因的报道，因此寻找miR-153的靶基因可以作为宫颈癌的治疗策略。

本研究证实miR-153靶向结合GALNT7的3′-UTR进而调控其表达。结果显示miR-153对GALNT7 mRNA和蛋白的表达量有显著抑制作用，这可能是因为miR-153与GALNT7 的mRNA序列互补配对结合导致其对mRNA降解，进而抑制GALNT7的蛋白表达。在顺时转染miR-153后，用CCK8实验可以看出，miR-153对宫颈癌细胞的增殖具有明显的抑制作用。本研究通过Transwell和划痕实验也证明，miR-153组宫颈癌细胞的迁移、侵袭能力明显下降。细胞的迁移和侵袭能力可能与肿瘤的复发、恶化息息相关。因此，本研究显示miR-153可能通过靶向调控GALNT7进而抑制宫颈癌细胞的发生和发展。最后，我们可以这样推测，下调靶基因GALNT7 mRNA和蛋白的表达，是miR-153抑制宫颈癌发生发展机制之一。