棉花施用脱叶剂对相邻未着药叶片生理活性的影响

王晓婧，李思嘉，刘瑞显,2*，张国伟，杨长琴,2，倪万潮,2

（1.江苏省农业科学院经济作物研究所/农业农村部长江下游棉花与油菜重点实验室，南京210014；2.江苏省现代作物生产协同创新中心，南京210014）

棉花是我国最重要的经济作物。近年来随着各大棉区植棉劳动力结构的改变和劳动力成本的大幅上升，传统植棉的比较效益持续降低，植棉面积大幅减少[1]。因此，急需大力发展棉花生产机械化，解决生产过程中劳动力短缺的问题[2]。推广机采棉已经成为我国棉花产业健康发展的必然选择[1]。

化学脱叶是棉花实现机械采收的核心技术，主要运用植物生长调节剂（主要是噻苯隆Thidiazuron,TDZ），干预棉花生理生化过程，加速植株衰老，实现脱叶[3]。化学脱叶效果好坏成为棉花机采能否顺利实施的关键。脱叶效果不理想、含杂率高往往造成棉花采收效率降低、清花成本增加和纤维品质下降[4]。因此，近年来众多研究者在棉花脱叶剂的剂型选择、剂量配方以及喷施时期、喷施方法方面进行了深入的研究[5-7]，筛选出了适应不同棉区的脱叶剂及其使用方法。但是目前我国棉花脱叶催熟技术并不完善，突出问题之一是棉花脱叶不彻底导致机采棉含杂率较高。这主要是由于新疆棉花采用“矮、密、早”的栽培模式，在黄河与长江流域棉区为实现机采棉的集中成铃吐絮，亦大幅提高种植密度[8]，棉田密度的提高常常导致喷雾机只能将脱叶剂喷施在中上部叶片上，而下部叶片因不能有效着药而不脱落，导致整体脱叶效果差[9]。

因此，随着我国棉花收获机械化进程的推进，迫切需要明确脱叶剂影响棉花叶片脱落发生的规律及生理机制[10]。前人认为对棉花进行化学脱叶，也是对其生长的胁迫[11]。高丽丽等[12]研究表明，喷施脱叶剂后棉花叶片发生光抑制，光系统II（Photosystem II,PSII）复合体受到损伤并伴随光合电子传递受阻，光合功能受损，而丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量升高、内源生长素（Auxin,IAA）含量下降，叶片膜系统受破坏严重[11]。但是，有关棉花喷施脱叶剂后，未着药叶片的生理功能如何变化，目前未见报道。而明确棉花喷施脱叶剂后未着药叶片的生理变化，将对完善机采棉脱叶催熟技术有重要的指导意义。

本文深入研究棉花喷施脱叶剂噻苯隆后，其相邻未着药叶片的光能吸收、传递、转换特性、内源保护酶活性及内源激素含量等生理指标的变化，旨在为提高脱叶效果，完善脱叶催熟技术，促进机采棉的迅速推广提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

于2017年3－8月在江苏省农业科学院人工气候室进行盆栽试验。以中棉所50（CCRI 50）为材料，挑选饱满均匀的种子，经3.0%（体积分数）的双氧水消毒10 min后用去离子水冲洗5次；之后放置于25℃的恒温箱中催芽24 h，再播种于装有基质的盆钵（直径10 cm，高15 cm）中，每盆播种2粒，于人工气候室内培养。待棉花子叶平展后，每盆留生长一致的壮苗1株，待棉苗长至7片真叶时进行以下2种处理：一是喷清水（对照，CK）；二是喷脱叶剂，将第4、5主茎叶表面用毛笔均匀涂抹0.1%的TDZ，使整张叶片正面均匀着药但无药滴滴下。每个处理种植50盆，共计100盆。人工气候室光源为生物钠灯，光照度（450±30）μmol·m－2·s－1，光照时间12 h，昼/夜温度（30±2）℃/（25±2）℃。分别在处理当天及处理后1 d、3 d、6 d、10 d测定第3主茎叶（未涂抹TDZ）的光合特性与叶绿素荧光参数，之后将叶片用液氮速冻后取回进行内源保护酶活性与内源激素含量的测定。

1.2 测定内容与方法

1.2.1脱叶率调查方法。分别在TDZ施用后1 d、3 d、6 d、10 d调查着药叶片（第4、5主茎叶）与未着药叶片（第3主茎叶）的脱叶率。

脱叶率=（施药前叶片数－施药后叶片数）/施药前叶片数。

1.2.2净光合速率。分别在TDZ施用当天及施用后1 d、3 d、6 d、10 d采用LI-6800便携式光合荧光仪（美国LI-COR公司）测定第3主茎叶的净光合速率（Pn）。仪器使用开放式气路，内置光源，光照度为1 300μmol·m－2·s－1。测定时每个处理重复5次。

1.2.3叶绿素荧光参数。与光合速率测定同步，用LI-6800（美国LI-COR公司）便携式光合荧光仪测定第3主茎叶的叶绿素荧光参数，测定时每个处理重复5次。

1.2.4内源保护酶活性与丙二醛含量。待1.2.2与1.2.3项目测定完后，立即将叶片取回，用液氮速冻后存于－40℃冰箱中用于内源保护酶活性与内源激素含量的分析。用氮蓝四唑（Nitro-blue tetrazolium,NBT）法测定超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活性[13]，用愈创木酚法测定过氧化物酶（Peroxidase,POD）活性[13]，用硫代巴比妥酸比色法测定丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量[13]。

1.2.5内源激素含量。按照Pan等[14]的方法进行样品内源激素的提取，之后采用高效液相色谱-串联质谱法[15]测定脱落酸（Abscisic acid,ABA）、生长素（Auxin,IAA）的含量。

1.3 统计分析

采用Microsoft Excel数据处理软件分析数据和制作图表，用SPSS 17.0统计软件进行方差分析，用最小显著差数法检验处理间平均值差异显著性。

2 结果与分析

2.1 施用TDZ对不同部位叶片脱落率的影响

由表1可见，棉花叶片涂抹TDZ后，其脱落率迅速上升，3 d后脱叶率为80%，6 d后TDZ涂抹的叶片全部脱落。而其相邻未着药叶片，在试验期间无任何脱落。

表1 施用脱叶剂（TDZ）对不同部位叶片脱落率的影响Table 1 Effect of defoliants application on the cotton leaf abscission

2.2 施用TDZ对未着药叶片净光合速率的影响

由图1可见，TDZ处理的未着药棉花叶片Pn迅速降低，处理后3 d时最低，6 d、10 d时逐渐回升。TDZ处理后1 d、3 d、6 d，未着药棉花叶片Pn较CK分别降低了39.6%、63.1%、39.4%，而在处理后10 d，与CK已无差异。

2.3 施用TDZ对未着药叶片叶绿素荧光参数的影响

2.3.1最大光化学效率。最大光化学效率（Maximum quantum yield of PSII,Fv/Fm）是暗适应下PSII的最大光化学效率或PSII原初光能转化效率[16]，可以作为衡量PSII光抑制程度的指标。由图2-A可见，TDZ处理后未着药棉花叶片Fv/Fm迅速降低，处理后1 d、3 d分别较CK降低了7.9%、7.8%，而在处理后6 d、10 d，未着药叶片与CK已无明显差异。

图1 施用脱叶剂（TDZ）对未着药叶片净光合速率的影响Fig.1 Effect of defoliants application on the net photosynthetic rate of cotton leaf without defoliants

图2 施用脱叶剂（TDZ）对未着药叶片叶绿素荧光参数的影响Fig.2 Effect of defoliants application on chlorophyll fluorescence of cotton leaf without defoliants

2.3.2量子产量与电子传递速率。PSII量子产量（Actual photochemical efficiency,ΦPSII）代表PSII非环式电子传递效率或光能捕获的效率，电子传递速率（Electron transport rate,Ret）代表的是表观光合量子传递速率[17]。由图2-B可见，TDZ处理后，未着药棉花叶片ΦPSII显著低于CK，处理后1 d、3 d、6 d分 别 较CK降 低 了29.5%、39.3%、27.7%，但10 d后，处理间已无明显差异。不同处理的Ret亦表现出相同的变化趋势，TDZ处理后的1 d、3 d、6 d，未着药棉花叶片较CK降低了25.7%、49.2%、42.3%（图2-C）。

2.3.3光化学猝灭系数与非光化学猝灭系数。光化学猝灭系数（Photochemical quenching,qP）反映PSII天线色素捕获的光能用于光化学电子传递的份额，非光化学猝灭系数（Nonphotochemical quenching,qNP）则反映PSII天线色素吸收的光能不用于光化学电子传递而以热的形式耗散掉的部分[17]。由图2-D，E可见，TDZ处理显著降低了未着药棉花叶片的qP，而增大了NPQ。TDZ处理后1 d、3 d、6 d未着药叶片qP分别较CK降低了22.1%、21.2%、18.7%，而其qNP较CK增大了42.4%、34.6%、32.8%。在处理后10 d，qP和qNP不同处理间差异较小。

2.4 施用TDZ对未着药叶片内源保护酶活性的影响

从图3看出，TDZ处理后1 d，未着药叶片的SOD活性与CK差异较小；处理后3 d、6 d、10 d，未着药叶片SOD活性显著高于CK。而POD活性变化较小，TDZ处理后1 d、3 d、6 d，未着药叶片的POD活性与CK差异较小；处理后10 d，未着药叶片的POD活性明显高于CK。

图3 施用脱叶剂（TDZ）对未着药叶片内源保护酶活性的影响Fig.3 Effect of defoliants application on endogenous enzyme activity of cotton leaf without defoliants

2.5 施用TDZ对未着药叶片丙二醛含量的影响

MDA作为活性氧毒害引发的细胞膜脂过氧化产物，其含量的变化可以表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境胁迫反应的强弱。由图4看出，TDZ处理后1 d，未着药叶片MDA含量与CK无差异；而随处理时间（3 d、6 d、10 d）的延长，未着药叶片MDA含量明显低于CK。

图4 施用脱叶剂（TDZ）对未着药叶片MDA含量的影响Fig.4 Effect of defoliants application on MDA contents of cotton leaf without defoliants

2.6 施用TDZ对未着药叶片内源激素含量的影响

由图5可见，TDZ处理后1 d，未着药叶片ABA含量与CK无差异；而在处理后的3 d、6 d，未着药叶片ABA含量明显低于CK；处理后10 d，2个处理间又无明显差异。IAA含量变化与ABA不同，TDZ处理后1 d、3 d、6 d、10 d，2个处理之间并无明显差异。

3 讨论

自1976年德国Cshering公司成功合成出TDZ以来，TDZ一直作为棉花大田的主要脱叶剂。但是，目前TDZ在叶片脱落过程中的生理、分子生物学机制仍不完全清楚[10-12]；而对有关棉花喷施脱叶剂后未着药叶片的生理功能如何变化，更未见研究。

3.1 施用TDZ对叶片光合特性的影响

图5 施用脱叶剂（TDZ）对未着药叶片内源激素含量的影响Fig.5 Effect of defoliants application on endogenous hormone contents of cotton leaf without defoliants

本研究发现，涂抹TDZ的棉花叶片脱落率在3 d后即超过了80%，而其相邻未着药叶片在整个试验过程中未见脱落。前人[12]研究表明，喷施脱叶剂后棉花叶片发生光抑制，PSII复合体受到损伤并伴随光合电子传递受阻，光合功能受损。本研究表明，施用TDZ后，相邻未着药棉花叶片净光合速率（Pn）迅速降低，但是Pn的降低并无持续性，在施药后10 d恢复到对照水平。进一步分析叶绿素荧光特性发现，与Pn表现趋势一致：施用TDZ后，相邻未着药棉花叶片Fv/Fm、ΦPSII、Ret以及qP迅速降低，而qNP迅速升高；但随后各叶绿素荧光参数恢复到对照水平。这说明在涂抹TDZ后，相邻未着药棉花叶片的光合性能与光反应中心部分失活，电子传递过程受阻，抑制光合色素将捕获的光能转化成化学能；但是，随着施药叶片的脱落，未着药叶片光合功能可以迅速恢复。

3.2 施用TDZ对叶片内源保护酶活性的影响

在外界胁迫下，作物体内SOD、过氧化氢酶（Catalase,CAT）、POD等内源保护酶协调作用可以有效地清除活性氧自由基，改善其抗逆性[18]。前人研究表明，棉花脱叶剂处理后初期叶片的SOD、POD和CAT活性上升较快，清除活性氧和保护细胞膜的能力有所增强，但在处理后期，SOD、POD和CAT活性下降，MDA含量上升，棉花叶片衰老加快[11]。而本研究表明，施用TDZ后，未着药棉花叶片的SOD活性显著升高，POD活性变化较小，MDA含量却显著低于CK。这可能是由于在TDZ处理初期（3 d内），施药叶片受胁迫较重，未着药叶片亦发生了胁迫反应，启动了抗氧化胁迫的应激反应，SOD活性升高；在而在处理后期施药叶片脱落，由于TDZ在棉株体内的传导性较差[21]，未着药叶片胁迫反应解除，但SOD活性仍较高，因此MDA含量低于CK。

3.3 施用TDZ对叶片内源激素含量的影响

化学脱叶主要是通过对植物体内内源激素的合成、运输、代谢、与受体的结合以及此后的信号传导过程进行干预，使原有的生长激素平衡遭到破坏，从而达到预定的脱叶催熟目的[3]。已有的研究表明，棉花喷施TDZ可显著促进叶片ABA的生成[19]。高丽丽等[11]研究亦发现，棉花喷施TDZ后叶片中ABA含量显著升高，而IAA含量逐渐降低。本研究发现，TDZ处理后，未着药叶片ABA含量并没有显著升高，IAA含量与对照相比亦无明显差异。这表明，未着药叶片的内源激素平衡受TDZ的影响较小，这可能也是未着药叶片并未脱落的主要原因之一。

进行化学脱叶是棉花机械化采收必不可少的重要技术措施。棉花脱叶效果的好坏直接影响最终机采效果，而目前生产中普遍存在棉花脱叶剂施药不均匀等问题[20]。本研究发现，棉花施用TDZ后着药叶片可以快速脱落，但是未着药叶片却不脱落。已有研究认为，脱叶催熟剂有很好的渗透作用，但大多没有传导作用[3]。因此，在生产中，必须从配方优化、喷施方法、器具选择等方面进行创新研究，保证脱叶剂药液与叶片充分接触，以提高脱叶效率。

另外，有关脱叶剂调节棉花叶片的生理与分子基础研究目前仍很薄弱，棉花叶片中TDZ的吸收与转运机理仍不清楚，棉铃不同发育阶段纤维品质形成对TDZ的反应机制也未见报道。因此，应进一步深入研究棉花脱落以及纤维发育等生理过程对化学脱叶剂的响应机理，并不断完善棉花脱叶催熟技术。