Dicer mRNA在肥胖高血压内脏白色脂肪组织中的表达*

刘红霞 施 真

滨州医学院基础医学院生理学教研室 烟台 264003

肥胖是全球性健康问题，严重威胁人类身体健康。众多研究均已证实肥胖和高血压密切相关[1]。肥胖中腹型肥胖与心血管疾病风险之间的关系尤为显著[2]，有研究表明内脏脂肪与皮下脂肪比与原发性高血压具有高相关性[3]。最新研究证实脂肪组织来源的microRNAs (miRNAs)是循环miRNAs的主要来源[4]，而Dicer是miRNAs形成的关键酶，在Dicer作用下前小RNA才能成为成熟miRNAs，因此Dicer表达量高低通过影响miRNAs可在多种疾病中发挥重要作用。但内脏脂肪组织中Dicer表达量在肥胖高血压患者是否异常尚无研究。本研究通过采集临床腹部择期手术患者内脏脂肪，检测其Dicer表达改变，分析其与肥胖高血压发病之间的关系，为探明肥胖高血压发病机制，寻找治疗靶点提供基础实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2014年12月至2018年8月某院收治的314例行择期腹部手术患者为研究对象，本研究符合作者所在单位人体试验伦理委员会所制定的伦理学标准，并取得病人的知情同意。年龄38～68周岁，男女不限；高血压标准为收缩压≥140 mmHg或舒张压≥90 mmHg；根据体重指数(Body Mass Index, BMI)分为肥胖和正常体重患者，肥胖BMI≥25 kg/m2，正常体重BMI<25 kg/m2。314例纳入研究患者中，>60岁者64例，31～40岁者81例，41～50岁者84例，51～60岁者85例。>60岁64例老年患者中，血压正常者30例，高血压患者34例。250例60岁以下患者中，正常体重正常血压者83例，单纯肥胖血压正常者56例，单纯高血压正常体重者30例，肥胖高血压患者81例。

1.2 主要仪器与试剂 Trizol购自美国Invitrogen公司；根据NCBI基因库数据应用在线引物设计软件primer 5.0设计Dicer和内参GAPDH检测引物，采用BLAST进行比对，由Invitrogen公司合成。 Dicer正义链引物：5′-GTACGACTACCACAAGTACTTC-3′，反义链引物：5′-ATAGTACACCTGCCAGACTGT-3′；GAPDH正义链引物：5′-GGGAGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3′，反义链引物：5′-CCATGCCAGTGAGCTTCCCGTTC-3′。荧光定量PCR试剂盒购自TransGen Biotech公司,反转录试剂盒购自Takara Bio公司。NanoDropND-1000分光光度计测定总RNA和cDNA含量和纯度。qRT-PCR仪器为ThermoFisher公司QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪。

1.3 方法

1.3.1 内脏脂肪组织采集 下腹腔内脏周围新鲜的脂肪组织200 mg，取样时间控制在10 min以内。剔除结缔组织等非研究所需的组织。在RNase-free的0.9%生理盐水中漂洗样品，以去除血渍和污物。装入冻存管，旋上盖子，迅速投入液氮冷却后将样品转移到-80℃保存。

1.3.2 脂肪组织总RNA的提取 每200 mg脂肪组织加1 mL trizol裂解，室温静置10 min，加入 0.2 mL氯仿，上下颠倒20 次，静置 15 min，4℃ 12 000 rpm离心15 min，取上清400～500μL，加入 0.5 mL 异丙醇，上下颠倒20 次，室温静置10 min，4 ℃ 12 000 rpm离心10 min，弃上清，加入1 mL 75% 冰乙醇，轻轻弹开洗涤沉淀，4 ℃ 7 500 rpm离心5 min，弃上清晾干，加入15 μL Nase Free H2O溶解，Nanodrop测浓度和质量，A280/A260≥1.8者可用于后续实验。

1.3.3 cDNA合成 根据试剂盒说明首先去除基因组DNA反应，10μL反应体系中包含1μg总RNA，2.0 μL 5 × gDNA Eraser buffer，1.0 μL gDNA Eraser，42 ℃ 2 min 4 ℃离心，加入4.0μL RNase Free H2O，4.0μL 5 × PrimeScriptBuffer2，1.0 μL RT Primer Mix，1.0μL PrimeScript RTEnzyme Mix I配成20 μL反转录反应体系，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 sec，4 ℃离心。

1.3.4 荧光定量PCR 根据试剂盒说明，20 μL反应体系为正义链和反义链引物各0.4 μL(终浓度0.2 μM)，2×TransStar Tip Green qPCR SuperMix (+Dye I/+DyeII) 10 μL，cDNA模板2 μL，RNase Free H2O 7.2 μL，反应步骤：94 ℃ 30 sec，94 ℃ 5 sec，50～60 ℃ 15 sec， 40个循环，72 ℃ 10 sec后溶解曲线。采用2(-△△CT)相对定量法比较各组差异。

2 结果

2.1 年龄对内脏白色脂肪组织Dicer mRNA表达的影响 如图1所示，与31～40岁患者(1.00±0.03)相比，41～50岁(1.46±0.34)，51～60岁患者(1.47±0.24)和60岁以上老年人(2.12±0.33)内脏白色脂肪组织Dicer mRNA表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)，但41～50岁(1.46±0.34)及51～60岁患者(1.47±0.24)两组患者之间差异无统计学意义(P>0.05)。与41～50岁患者(1.46 ± 0.34)相比，60岁以上老年人(2.12 ± 0.33)内脏白色脂肪组织中Dicer mRNA表达增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。与51～60岁患者(1.47±0.24)相比，60岁以上老年人(2.12±0.33)内脏白色脂肪组织中Dicer mRNA表达增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2 单纯肥胖对内脏白色脂肪组织Dicer mRNA表达的影响 如图2所示，60岁以下患者中，与正常体重正常血压者(1.00±0.21)相比，单纯肥胖正常血压患者(0.98±0.11)内脏白色脂肪组织中Dicer mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 不同年龄组内脏白色脂肪组织Dicer mRNA表达水平

图2 非老年单纯肥胖内脏白色脂肪组织Dicer mRNA表达水平

2.3 老年高血压对内脏白色脂肪组织Dicer mRNA表达的影响 如图3所示，60岁以上患者中，与正常血压患者(1.00±0.10)相比，高血压患者(0.79±0.12)内脏白色脂肪组织中Dicer mRNA表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 肥胖高血压对内脏白色脂肪组织Dicer mRNA表达的影响 如图4所示，60岁以下患者中，与正常体重正常血压者(1.00±0.12)相比，单纯高血压患者(0.85±0.10)和肥胖高血压患者(0.59±0.06)内脏白色脂肪组织中Dicer mRNA表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)；且与单纯高血压患者(0.85±0.10)相比，肥胖高血压患者(0.59±0.06)内脏白色脂肪组织中Dicer mRNA表达降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图3 老年高血压内脏白色脂肪组织Dicer mRNA表达水平

图4 非老年高血压内脏白色脂肪组织Dicer mRNA表达水平

3 讨论

本研究发现随年龄增长，内脏白色脂肪组织中Dicer mRNA表达显著升高，而老年高血压患者内脏白色脂肪组织中Dicer mRNA表达显著降低；去除年龄因素后，单纯肥胖对内脏白色脂肪组织中Dicer mRNA表达无显著影响，而单纯高血压患者内脏白色脂肪组织中Dicer mRNA表达显著降低，肥胖高血压患者内脏白色脂肪组织中Dicer mRNA表达降低更显著。这些结果表明内脏白色脂肪组织中Dicer mRNA表达降低参与多种高血压，如老年高血压，尤其是肥胖高血压的发生、发展。

高血压是严重危害人类健康的常见病，发病率高，且治疗效果不够理想[5-6]，如何有效防治高血压是医学界急需攻克的重大医学难题。肥胖是高血压的重要易感因素。肥胖的关键组织——脂肪组织，一直被认为只有能量储存和平衡能量代谢的作用。近年来脂肪组织逐渐被认为是内分泌器官之一，其分泌的激素可调控其他组织器官功能，在包括高血压在内的代谢综合征中发挥重要作用[7]。另外，众多研究表明miRNAs在多种疾病[8]，包括心血管疾病发病中发挥重要作用[9]。最新研究结果[10]表明脂肪组织是循环血中microRNAs的主要来源，随血液循环运输至其他组织，并调节其他组织基因表达和功能。而Dicer是miRNAs形成的关键酶，在Dicer作用下前小RNA才能成为成熟miRNAs，因此Dicer表达量高低通过影响miRNAs可在多种疾病中发挥重要作用。因此本研究选择内脏白色脂肪组织为研究对象，观察其中Dicer表达量高低与高血压的关系。

本研究收集2017年12月至2018年8月某院收治的28例行择期腹部手术患者内脏白色脂肪组织，并采集患者年龄、身高、体重、血压指标，经荧光定量PCR检测内脏白色脂肪组织中的Dicer mRNA表达量高低。结果发现与正常血压患者相比，高血压患者内脏白色脂肪组织中的Dicer mRNA表达量并无显著变化，这说明可能存在其他因素与内脏白色脂肪组织中的Dicer mRNA表达增加相关，从而抵消了高血压患者Dicer mRNA表达改变。因此本研究分别分析了年龄和肥胖与内脏白色脂肪组织Dicer mRNA表达的关系。首先将正常血压患者按年龄分为31～40岁、41～50岁、51～60岁及60岁以上四组进行比较，结果发现虽然51～60岁与41～50岁两组无显著差异，但均较31～40岁患者内脏白色脂肪组织Dicer mRNA表达显著升高，且60岁以上患者升高更显著，这些结果表明，随年龄增长内脏白色脂肪组织中的Dicer mRNA表达显著增加。其次，将正常血压患者按体重指数分为不肥胖和肥胖两组，结果发现单纯肥胖因素并不影响内脏白色脂肪组织Dicer mRNA表达。

众所周知，年龄也是高血压的重要风险因素。随着年龄的增长，高血压发病率呈显著增高趋势。本研究发现，与60岁以上正常血压患者相比，60岁以上的高血压患者内脏白色脂肪组织中的Dicer mRNA表达显著下降。这说明内脏白色脂肪组织中的Dicer mRNA表达下降与老年高血压有密切关系。而去除年龄因素后，在60岁以下患者中，与正常体重、血压患者相比，单纯高血压患者内脏白色脂肪组织中的Dicer mRNA表达量显著下降。以上结果表明，高血压患者无论年龄高低，内脏白色脂肪组织中的Dicer mRNA表达量均显著下降。另外，去除年龄因素，即在60岁以下患者中，与正常体重、血压者相比，肥胖高血压患者内脏白色脂肪组织中的Dicer mRNA表达显著降低，且较正常体重高血压者降低更显著，这些结果表明去除年龄因素后，内脏白色脂肪组织中的Dicer mRNA表达降低与肥胖高血压患者更显著相关。

综上所述，内脏白色脂肪组织中Dicer mRNA表达降低参与高血压，尤其是肥胖高血压的发生、发展，为以后更好的研究肥胖高血压发病机制奠定了理论基础。