IL-33预处理对小鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用

朱 平，谢 莉，董传江

缺血再灌注损伤(ischemia and reperfusion injury,IRI)是指在缺血的基础上恢复血流后，组织器官的损伤反而加重的病理生理现象[1]。肝脏缺血再灌注损伤(liver ischemia and reperfusion injury,LIRI)以肝细胞缺血坏死为特征，临床上主要见于肝部分切除术、肝移植、创伤和低血容量性休克等[2]。但目前临床上针对LIRI的防治仅是支持疗法，因此，寻找防治LIRI的有效手段具有重要临床意义。

白细胞介素(IL)-33最近被鉴定为孤儿受体ST2(IL-1RLI)的配体，除了表达在淋巴器官的高内皮静脉细胞核外，还组成性地表达于正常人的血管内皮细胞、消化系统的上皮细胞以及淋巴组织纤维细胞[2]。IL-33在疾病中扮演双重角色：它通过增强Th2型反应保护机体免受寄生虫感染和动脉粥样硬化，同时也能加重由Th2细胞和肥大细胞介导的炎症性疾病[3]。但IL-33在肝脏缺血再灌注(I/R)中的作用未见报道。本研究将探讨IL-33在小鼠LIRI中的作用及可能机制。现作报道。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂 75只雄性SPF级C57BL/6小鼠,8～10周龄，体质量20～25 g。均购自北京华阜康生物科技有限公司,按照清洁级动物标准饲养和管理。兔抗小鼠IL-33多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；重组小鼠IL-33蛋白购自北京方程佰金科技有限公司；ALT/AST检测试剂盒购自Sigma公司；髓过氧化物酶(MPO)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。IL-17A ELISA试剂盒购自Ebioscience公司。本实验使用的其他试剂均为分析纯。

1.2 I/R模型建立[4]及分组 小鼠购进后在SPF级动物房饲养1周，实验前12 h禁食不禁水。将小鼠随机分为3组：假手术组(Sham组)、磷酸盐缓冲液I/R组(PBS+I/R组)及重组IL-33蛋白组(rIL-33+I/R组)，每组各15只。以戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，乙醇消毒腹部皮肤，沿腹部正中线切口入腹，在手术显微镜下从周围组织中分离出支配肝脏左、中、尾叶的肝动脉和门静脉及胆管，应用无损伤微血管夹阻断以上血管，造成70%肝脏缺血，缺血部分肝组织颜色由红润转为苍白，提示阻断成功。随后关闭腹腔。缺血60 min后再重新打开腹腔，移走无损伤微血管夹以解除阻断，恢复肝脏血流供应，肝脏颜色在1 min内由苍白变为红润提示再灌注成功。用3/0手术丝线缝合关闭腹腔。Sham组小鼠除了不夹闭无损伤微血管夹外其余处理同I/R组。每组分别于再灌注后6 h、12 h及24 h各时间点处死小鼠，处死前经眼球取血，用预冷的0.9%氯化钠注射液冲洗肝脏，直至变白，切取I/R肝脏组织，分别行生化及形态学检查。

1.3 IL-33表达检测 将30只小鼠随机分为6组(Sham组，再灌注后1 h、3 h、6 h、12 h及24 h组)。组织中IL-33表达采用免疫组化SP法检测，操作步骤按试剂盒说明书进行，肝组织石蜡切片经脱蜡、水化、3%甲醇、H2O2避光孵育、高压抗原修复后，加入兔抗小鼠 IL-33抗体(1∶400稀释)，孵育并洗涤后滴加二抗，光镜下观察控制DAB显色时间，苏木精复染细胞核，梯度乙醇脱水干燥，中性树胶封固。用PBS代替一抗作阴性对照。参考陈杰等[5]研究方法，血清中IL-33表达采用ELISA检测法，根据试剂盒说明书进行。

1.4 IL-33预处理 参考FREITAS等[6-7]预处理方法，PBS+ I/R组于缺血前 60 min腹腔注射1 mL PBS溶液；rIL-33+I/R组小鼠于缺血前60 min腹腔注射1 mL的重组rIL-33蛋白溶液(5 μg/mL)；Sham组不夹闭无损伤微血管夹，余处理同I/R组。

1.5 肝功能指标检测 将小鼠血液标本以3 000 r/min离心10 min，留取上层血清，根据试剂盒说明检测ALT和AST含量。

1.6 血清IL-17A检测 参考DUAN等[8]研究方法，按不同组在不同时间点处死小鼠取血，室温放置30 min后，4 ℃下2 000 r/min离心分离血清。血清中IL-17A浓度根据试剂盒说明书进行检测。

1.7 肝脏病理学评价 将小鼠肝脏组织标本经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片，二甲苯中常规脱蜡至水，苏木精染色10 min，流水冲洗后伊红染色2 min，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。光镜下观察各组肝脏组织变化。

1.8 MPO检测 取I/R后肝脏组织匀浆,严格按MPO活性测定试剂盒说明书步骤要求,460 nm波长测量各管吸光度值。根据说明书提供公式,计算MPO活性数值。

1.9 统计学方法 采用方差分析和q检验。

2 结果

2.1 小鼠LIRI过程中IL-33表达的变化 本研究检测了小鼠缺血60 min，再灌注24 h血清中及肝脏组织表达IL-33的情况。小鼠缺血60 min，再灌注3 h后血清中IL-33开始明显升高(P<0.05)，12 h达高峰，24 h后逐渐下降(见图1)。免疫组化结果显示，IL-33在小鼠缺血60 min，再灌注3 h后表达升高，一直持续至24 h(IL-33阳性细胞显示为棕色)(见图2)。

2.2 肝功能评价 小鼠缺血60 min再灌注12 h，PBS+I/R组血清ALT及AST含量明显高于Sham组 (P<0.01)。在缺血60 min，再灌注12 h，rIL-33+I/R组血清中ALT及AST水平明显低于PBS+I/R组(P<0.01) (见表 1)。

表1 小鼠I/R 12 h后各组血清ALT及AST变化(ni=15;U/L)

2.3 肝脏损伤程度 HE染色显示Sham组肝组织肝细胞形态正常，肝小叶结构正常(见图3)。与Sham组相比，PBS+I/R组在缺血60 min再灌注12 h后，肝脏组织结构明显紊乱，肝脏有大面积缺血坏死，肝细胞明显肿胀，变性，坏死区有炎性细胞浸润；rIL-33+I/R组小鼠肝脏损伤较PBS+I/R组明显减轻。

2.4 肝脏组织MPO检测结果 结果显示：与Sham组相比，PBS+I/R组在缺血60 min，再灌注12 h后肝脏组织MPO含量明显升高(P<0.01)；rIL-33+I/R组较PBS+I/R组在缺血60 min，再灌注12 h后肝脏组织MPO含量明显降低 (P<0.01)(见表2)。上述结果提示，rIL-33+I/R组较PBS+I/R组在小鼠肝脏缺血60 min，再灌注12 h后中性粒细胞浸润明显减少。

2.5 IL-33预处理能抑制IL-17A的表达 结果显示，小鼠肝脏缺血60 min,再灌注12 h PBS+I/R组血清中IL-17A含量较Sham组明显升高(P<0.01),rIL-33+I/R组较PBS+I/R组在小鼠肝脏缺血60 min，再灌注12 h后血清中IL-17A含量明显减少(P<0.01)(见表3)。

表2 小鼠I/R 12 h各组肝脏组织MPO含量(ni=15;U/g)

表3 小鼠肝脏I/R 12 h血清中IL-17A表达(ni=15;pg/mL)

3 讨论

IL-33的mRNA表达于人和鼠的多种器官和细胞。在蛋白水平，IL-33主要表达在成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞[9-10]，特别是高内皮小静脉[11]。本研究结果提示在小鼠肝脏I/R模型中，肝细胞也可以表达IL-33，再灌注后12 h达高峰，24 h逐渐降低，提示IL-33参与了小鼠LIRI。我们的预备实验结果提示，提前60 min腹腔注射rIL-33，IRI开始后血清中IL-33浓度最高，因此我们采用提前60 min预处理IL-33，这种预处理方法与FREITAS等[6-7]研究一致。

IL-33可通过其受体ST2保护小鼠心脏IRI，其保护机制可能与IL-33抑制心肌细胞凋亡有关。有学者进一步研究[12]发现，降低IL-33的表达能加重糖尿病小鼠心脏IRI，其机制可能与IL-33抑制PKCbII激活有关。最近研究[13]发现，IL-33能保护小鼠脑IRI，其机制可能与促进Th2反应，抑制Th17细胞反应有关。但也有研究[14]发现，IL-33能加重顺铂引起的急性肾损伤，其机制可能与IL-33促进CD4+细胞介导的趋化因子CXCL-1的表达有关，可见IL-33具有两面性，它在有些疾病中起保护作用，但在另外一些疾病中起促进作用。但有关IL-33在肝脏I/R中的作用鲜有报道。

我们的研究结果提示，IL-33能抑制中性粒细胞的浸润而保护LIRI。但IL-33如何抑制中性粒细胞浸润呢? 有大量文献报道，IL-17A可促进中性粒细胞的募集而参与炎症的发生、发展。有研究[15]证明，IL-17A基因敲除小鼠能明显抑制中性粒细胞浸润而保护LIRI，提示IL-17A在LIRI过程中趋化中性粒细胞的浸润起关键作用。IL-17A可通过作用于巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞及成纤维细胞，分泌多种趋化因子促进中性粒细胞的浸润[16]。也有研究[17]结果显示，HMGB1可以通过抑制Th17细胞分泌IL-17A，从而抑制中性粒细胞的浸润，而延长心脏移植物的存活，提示IL-17A在中性粒细胞浸润过程中起关键作用。在LIRI过程中，中性粒细胞浸润到肝脏引起肝脏损伤依赖于CD4+T细胞，结果同时显示应用抗体清除CD4+T细胞能抑制中性粒细胞浸润而保护LIRI。CD4基因敲除小鼠能减少中性粒细胞浸润保护LIRI，而且应用抗IL-17抗体中和IL-17后，能通过抑制CXCL2的表达而抑制中性粒细胞浸润，进一步提示CD4+T细胞分泌的IL-17A在LIRI过程中中性粒细胞浸润起到关键作用。

有学者研究[13]发现，在小鼠脑IRI过程中，IL-33能通过促进Th2型反应而抑制Th17细胞的反应。但在肝脏I/R过程中IL-33对IL-17A引起中性粒细胞浸润的机制未见报道。我们的研究发现，在小鼠I/R过程中，IL-33能够减少中性粒细胞浸润，从而保护小鼠IRI。我们进一步探讨了加用rIL-33IL-17A水平的变化，提示IL-33能抑制IL-17A的表达，与上述研究[13]结果一致。因此，我们推测IL-33通过抑制IL-17A的表达，从而减少中性粒细胞的浸润而保护小鼠IRI。

DUAN等[8]研究结果提示IL-33在三硝基苯磺酸诱导的小鼠实验性结肠炎中表达升高，而且应用rIL-33预处理能保护小鼠实验性结肠炎。与DUAN等[8]研究结果一致，我们研究发现IL-33在小鼠肝脏I/R 3 h后开始升高，12 h达高峰，研究结果提示IL-33在此过程中发挥保护效应，因此，我们推测IL-33在小鼠I/R过程中表达升高是反馈性的升高，是机体自我调节IRI的机制之一，我们预先给予IL-33可以更好的保护小鼠IRI。我们的研究也进一步证实了上述推测。

本研究的不足之处在于未用ST2抗体阻断IL-33/ST2信号通路进行研究，因此，本研究结果不能排除IL-33除了ST2受体之外，还可能有其他信号通路参与保护LIRI。同时，本研究也未设置IL-33抗体组进行对比研究，探讨是否加入IL-33抗体后会加重LIRI。以上是本研究的两个不足之处，本课题在以后的研究中将进一步完善。

综上所述，IL-33能保护小鼠LIRI，其可能机制与IL-33抑制IL-17A表达、从而抑制中性粒细胞浸润有关。