扶正祛邪复方对K562/A02细胞耐药性的逆转作用*

李秀军， 张雨凝， 张玉珊， 雷婷

贵阳中医学院第二临床医学院(贵州贵阳 550001)

白血病多药耐药(multidrug resistance,MDR)是白血病化疗失败和复发的主要原因之一。目前很多西药如维拉帕米、奎尼丁、环孢菌素A等均具有一定的耐药逆转作用，但当这些药物与其转运蛋白底物相结合时，可能会导致正常细胞和组织对化疗药物的自我保护作用下降，产生毒性不良反应，从而限制了该类药物在临床上的运用[1]。中药具有资源丰富、作用靶点广泛、毒性不良反应小的优势，成为耐药逆转剂研究的热点，但目前对中药逆转剂的研究或为清热解毒、或为益气养阴，而将二者相结合的扶正祛邪法作为逆转剂的研究几乎空白。对耐药机制的研究也集中在对p糖蛋白、Bcl-2等指标的影响，而对耐药细胞凋亡率的影响的研究比较少。而MDR形成的中医病机主要为“伏邪留于阴分”，治疗上需使阴分之邪透出于阳分，方可达到扶正祛毒之功。本课题率先将养阴透邪与清解毒邪相结合，以扶正祛邪法逆转MDR，并通过检测凋亡率探讨其逆转机制。在临床工作中，课题组也发现扶正祛邪法能有效减轻化疗不良反应、提高临床疗效及患者生存质量、延长生存期[2-3]。笔者自2015年5月至2017年5月期间，以体外实验的方式观察了扶正祛邪中药复方含药血清对人慢性粒细胞白血病急变期耐药细胞K562/A02的抑制率以及凋亡率的表达的影响，实验运用MTT法检测含药血清对K562/A02细胞的抑制率，并以流式细胞术检测该细胞凋亡的情况，结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人慢性粒细胞白血病急变期耐药细胞株K562/A02(购于中国医学科学院上海细胞库)。

1.2 药品及试剂 细胞凋亡检测试剂(AnnexinV-FITC):InvitrogenCorportation。阿霉素配制液(ADM)：10 mg/支，3 mL灭菌双蒸水加入瓶中，待药物充分溶解后，加入到盛有97 mL的无菌双蒸水的玻璃瓶中，所配制液体浓度100 μg/mL，分装后于4℃环境下保存。干扰素配制液：300万U/瓶，3 mL灭菌双蒸水加入到瓶中，使药物充分溶解后，加入到盛有97 mL的无菌双蒸水的玻璃瓶中，使其终浓度为3万U/mL，分装后于4℃环境下保存。扶正祛邪中药复方(由贵阳中医学院第二附属医院制剂室制备成中药浓缩剂，每毫升含1 g生药)主要成分：人参20 g，黄芪30 g，麦冬15 g，五味子15 g，青黛10 g(包煎)，白花蛇舌草30 g等。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 将细胞株K562/A02置于37℃、5%CO2条件下，接种于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，在培养体系中加入浓度为1 μg/mL的ADM维持其耐药性，取对数生长期细胞，2～3 d传代1次，并更换细胞液。

1.3.2 含药血清的制备[4]将28只新西兰大白兔[体重(3.5±0.5)kg，购于重庆腾鑫生物技术有限公司]。随机分成空白对照组和低、中、高剂量实验组，每组7只，以扶正祛邪复方中药液灌服，低剂量组灌服3 g(生药)/kg(体重)中药液、中剂量组灌服6 g/kg中药液、高剂量组灌服12 g/kg中药液，连续灌胃3 d，每天灌胃2次，空白对照组正常喂养，于最后一次给药2 h后，在无菌条件下取股动脉血，分离采集血清，同组血清混合，使用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，置于-20℃冰箱内保存备用。

1.3.3 MTT法检测不同剂量含药血清对K562/A02细胞的抑制率 将含药血清分为3组：高剂量含药血清组(HD组)、中剂量含药血清组(MD组)，低剂量含药血清组(LD组)。将处于对数生长期的K562/A02细胞离心，弃上清，培养液重悬细胞后，调整细胞数为1×105/mL，每个孔放置180 μL，将细胞接种于96孔培养板中。含药血清组每孔中加入不同剂量含药血清20 μL；以不含药正常培养的K562/A02细胞作为对照组，使每孔终体积为200 μL，每组均需设3个平行孔，每板需加入RPMI-1640、生理盐水作为空白调零孔，其目的是为了矫正其他孔的检测值；为排除边缘效应，周边孔均加入200 μL的生理盐水。将96孔板置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养，72 h后每孔加入MTT配置液20 μL，配置液的浓度为5 mg/mL，放入培养箱中继续培养。4 h后取出离心，去上清。每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL，完毕后放置于摇床上低速振荡10 min，使每孔中的结晶物得以充分溶解。全自动酶标仪测定各孔吸光度值(OD)。实验重复3次，据上述实验的结果，细胞抑制率=(1-实验组平均OD/对照组平均OD)×100%。

1.3.4 流式细胞术检测经含药血清处理后K562/A02细胞的凋亡率 分组：(1)高剂量含药血清+ADM组(HD+ADM组)；(2)中剂量含药血清+ADM组(MD+ADM组)；(3)低剂量含药血清+ADM组(LD+ADM组)；(4)阴性对照组：空白兔血清+ADM组(NS+ADM组)；(5)阳性对照组：干扰素+ADM组(IFN+ADM组)。

将处于对数生长期的K562/A02用细胞培养液制成1×106/mL的细胞悬液，接种于24孔培养板中培养。实验组中加入高、中、低剂量含药血清进行培养，阴性对照组中加入空白兔血清培养，阳性对照组加入干扰素培养[5]，每组均设3个平行孔，每组适应性培养6 h后均加入不同浓度的ADM 20 μL。培养24、48、72 h后收集细胞，将细胞转入EP管中，离心(2 000 r/min，5 min)，弃上清，4℃PBS洗2次，调节其密度为1×106/mL，加入5 μL AnnexinV-FITC混合后，加入5 μL碘化丙啶(PI)混匀，取100 μL上述细胞悬液于5 mL流式管中，室温避光反应15 min，上机检测得出相应的细胞凋亡百分率。

2 结果

2.1 MTT法检测不同剂量含药血清对K562/A02细胞的抑制率 细胞的抑制率为高剂量含药血清组>中剂量含药血清组>低剂量含药血清组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

组别OD值抑制率(%)对照组6.951 4±0.002 3 HD组2.780 0±0.001 160.015 0±0.048 6∗∗MD组4.030 2±0.003 442.175 1±0.095 4∗LD组4.650 1±0.001 330.769 5±0.036 9∗

与对照组比较 *P<0.05, **P<0.01

2.2 流式细胞术检测含药血清对K562/A02细胞凋亡率的影响 K562/A02经扶正祛邪中药复方含药血清处理72 h后流式细胞术检测凋亡所见图1。

流式细胞术检测结果显示各组在24 h的凋亡率较低，在72 h后的凋亡率最高。各组间在72 h后进行比较：HD+ADM组>干扰素+ADM组>MD+ADM组>LD+ADM组>NS+ADM组，具体见表2。

3 讨论

多药耐药的白血病患者一般经历了多次联合化疗的攻伐，精气耗伤严重，患者多表现为气血阴阳虚损，无力祛邪外出。而由于化疗药物的局限性，白血病细胞并不能完全消除，伏留于人体血脉、骨髓等至阴之分，形成所谓“伏毒”。周仲瑛指出“伏毒”即是邪毒潜藏于人体某个部位，其病理特性为伏而不觉、发时始显，具有表现隐伏、缠绵、暗耗、毒性猛烈、病情危重、迁延难愈等临床特点[6-7]。这与多药耐药导致的白血病缓解率低、复发率高、预后较差等特点相一致。因而白血病多药耐药患者的病理状态为正气亏虚、脏腑功能失调而余毒留伏阴分。黄礼明等[8]认为余毒留伏阴分，清热解毒之品对阳分邪毒有效，对于阴分邪毒却能力有限，难达病所，而单纯的扶正培本之品难以托毒外出，故应以扶正祛邪为治疗原则，结合养阴透邪和清解毒邪之品，使阴分之邪透出于阳分，再行祛毒之剂以收祛毒之功。

目前对中药逆转剂的研究或为清热解毒、或为益气养阴，[9-10]，而将二者相结合的扶正祛邪法作为逆转剂的研究较少。对耐药机制的研究也集中在对p糖蛋白、Bcl-2等指标的影响，而对耐药细胞凋亡率的影响的研究比较少。在白血病多药耐药发生机制中，细胞凋亡受抑是多药耐药化疗失败的重要机制之一，因此如何诱导细胞凋亡对逆转多药耐药具有重要的意义[11]。

扶正祛邪中药复方遵循“扶正固本、清解伏毒”的组方原则组方，现代药理学研究证实，方中主药均具有诱导细胞凋亡及抗肿瘤的作用[12]。笔者在前期通过大量实验研究发现，扶正祛邪复方含药血清可增加长春新碱(VCR)对白血病耐药细胞HL60/VCR的细胞抑制率，并且能够降低凋亡抑制基因Bcl-2的表达。与INF联合还可以下调P-gp表达，进而发挥逆转耐药的作用[13-14]。

本实验中我们在典型耐药细胞K562/A02中加入不同剂量的含药血清以观察含药血清对耐药细胞的抑制率。结果显示抑制率为高剂量含药血清组>中剂量含药血清组>低剂量含药血清组，高剂量含药血清组分别与中、低剂量含药血清组比较差异有统计学意义(P<0.01)，说明含药血清对细胞的增殖具有一定的抑制作用，对细胞的抑制作用与药物剂量呈正比。实验证明扶正祛邪中药复方中药具有直接抑制白血病细胞增殖的作用，能够起到逆转多药耐药的作用。同时，试验检测了经含药血清处理后的各组细胞凋亡率的表达。结果显示，不同剂量的含药血清均可随着时间的延长诱导细胞凋亡，在72 h，高剂量含药血清组的凋亡率达到最高为50.63±1.36，高剂量含药血清组与中剂量含药血清组、低剂量含药血清组、干扰素组、空白兔血清组的凋亡率进行比较具有显著性差异(P<0.01)；各组实验均在72 h的凋亡率最高，但坏死细胞也增多。由此可知，扶正祛邪中药复方含药血清不仅能够直接抑制白血病细胞增殖，且能以剂量及时间依赖的方式诱导耐药细胞的凋亡，实验提示扶正祛邪复方中药具有逆转多药耐药的作用，且其发挥逆转作用的机制与其促进耐药细胞的凋亡密切相关。

A:HD+ADM组；B:MD+ADM组；C:LD+ADM组；D:IFN+ADM组;E:NS+ADM组

图1流式细胞术检测结果

组别24 h凋亡率48 h凋亡率72 h凋亡率HD+ADM组10.72±0.2430.81±1.56∗∗△△50.63±1.36∗∗△△▲#MD+ADM组9.20±0.9020.75±0.48∗△33.02±0.39∗∗△LD+ADM组8.87±0.709.44±0.8315.85±0.37IFN+ADM组9.34±0.3523.50±1.08∗△35.38±0.94∗∗△NS+ADM组6.91±1.189.16±1.0714.40±0.36

与NS+ADM组比较 *P<0.05, **P<0.01; 与LD+ADM组比较 △P<0.05, △△P<0.01;▲与IFN+ADM组比较P<0.05;#与MD+ADM组比较P<0.05