猪瘟、猪蓝耳病、副猪嗜血杆菌和猪链球菌多重混合感染的诊断

梁海英，张爱琼，曾智勇，王 彬，徐 国，咸 文，何小莉，陈 娟，吴好叶

（贵州大学，贵州 贵阳 550025）

猪瘟（CSF）是由于猪只感染猪瘟病毒（CSFV）后所引起的一种具有传染性的疾病。该病高度接触性传染，短时间内急性发病可导致猪只死亡，临床感染表现为持续性高热、全身性点状出血、脾脏出现梗死阻塞，通常又称为 烂肠瘟”。因其对养猪业的发展造成巨大的危害，在我国将其列为一类传染病[1]。猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)一种以损害母猪繁殖系统以及猪只呼吸系统疾病的病毒性传染病，因感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV）而引起，通常称为 猪蓝耳病”。怀孕母猪感染 PRRSV后会出现流产现象，后期产出胎儿死亡、孱弱以及呈木乃伊样等；PRRSV对保育猪的感染率和死淘率较妊娠母猪高，导致猪只生长发育性能很大程度上降低，临床上猪只大多表现为呼吸不畅、食欲不佳、持续高热不下、精神萎靡，感染高致病性猪蓝耳病的猪只发病率和死亡率均较高[2]。副猪嗜血杆菌病（HSP）是猪只感染副猪嗜血杆菌所引起，具有传染性，临床上常出现关节炎、脑膜炎和浆膜炎等症状又称革拉氏病，其对保育阶段的猪只造成的威胁最大，常与其他病毒或细菌以混合感染的形式存在[3]。猪链球菌病是一种发病急、传染性高的人畜共患病，因接触致病性猪链球菌而导致感染[4]。

2018年7月，贵州某养殖场育肥猪在隔离免疫期间发病，出现高热稽留、喘气、呼吸困难、食欲不振等症状，猪场使用多种抗生素，未见有明显效果，先后死亡400余头，导致猪场损失惨重。为确诊育肥猪发病死亡病因，故将2头症状较为典型的发病猪送检，现将检测诊断结果报告如下，以供参考。

1 临床及发病特征

据述，2018年7月，贵州某养殖场从贵州多个地方收购育肥仔猪800余头，在隔离期间免疫猪瘟疫苗后猪只相继出现病症，临床上表现为高烧不退、饮食不佳、精神萎靡、呼吸急促，采用多种抗生素药物治疗未见有效，发病期间猪只先后死亡400余头；送检猪只体表污秽，极度消瘦。

2 病理解剖特征

将2头极度消瘦的送检病猪进行剖检观察，可见其中1头育肥猪胸腔积液呈典型 绒毛心”、肺脏与胸腔粘连，腹腔脏器表面有纤维素性渗出物（图1）；另1头脾脏严重肿大，肺炎病症明显，在肺门、腹股沟等处的淋巴结有严重的肿大出血现象（图2，3）；2头病猪肾脏均有散在出血点（图4）。

3 病毒学和细菌学诊断检测

通过对送检猪的临床发病特性和病理剖检观察结果，初步确定送检病猪可能存在细菌和病毒混合感染。根据送样要求，对病猪组织样品进行CSFV和PRRSV的RT-PCR检测，同时对猪圆环病毒病和猪伪狂犬病2种病毒进行检测，以及细菌检测。

图1 腹腔脏器表面有纤维素性渗出物

3.1 病毒检测

根据实验需求，适量采集2头送检病猪内脏组织（脾、肺、淋巴结等）合在一起，匀浆反复冻融3次后13 000 r/min离心7 min，取上清， 应用 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0 核酸提取试剂盒提取核酸，分别对 CSFV、PRRSV、 PRV 和 PCV2 进行检测。RT-PCR 反应体系（25.0 μL）：2 倍一步法的 Buffer 12.5 μL， 核酸模板 4.5μL， 引物 F/R 各 0.5μL， 一步法的酶 1.0 μL，RNase Free ddH2O 6.0 μL，反应条件为50 ℃ 40 min；95 ℃ 5 min ；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，37个循环；72℃ 10 min。PCR反应体系为（25.0 μL）：2hTaq酶 12.5 μL，ddH2O 6.0 μL， 引 物R/F各1.0 μL，核酸模板4.5 μL。PRV反 应 条 件 为：94℃ 5 min ；94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，38 个循环；72 ℃ 10 min。PCR 反应结束后，将获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳，并拍照记录。结果显示，CSFV和PRRSV均呈阳性，PCV2和PRV均呈阴性（如图5）。

图2 腹股沟等处的淋巴结严重的肿大出血

图3 肺门淋巴结肿大出血

3.2 细菌检测

图4 病猪肾脏出现散在出血点

图5 病毒PCR检测结果

无菌剪取少量的病猪新鲜肺脏、脾脏分别于胰酪大豆胨（TSB）液体培养基（含5%的胎牛血清）中培养12 h后，分别取新鲜培养的脾脏和肺脏菌液进行革兰氏染色。在显微镜下观察，结果发现在肿大的脾脏培养物中有链球菌（图6 A）和肺脏培养物中疑似副猪嗜血杆菌样的革兰氏阴性小杆菌（图6 B）。

为确定该革兰氏阴性菌是否为副猪嗜血杆菌，将培养的菌液离心，用 PBS清洗处理2次，使用生工生物公司细菌 DNA提取试剂盒根据革兰氏阴性菌提取方法提取细菌 DNA，反应体系为（25.0 μL）：金盾Mix 21.0 μL，引物R/F各1.0 μL，DNA核酸模板2.0 μL。副猪嗜血杆菌PCR反应程序为：94℃ 5 min ；94 ℃ 50 s，63 ℃ 45 s，72 ℃ 1min，36 个循环；72 ℃ 10 min。将反应后获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。检测结果显示，副猪嗜血杆菌病为阳性（如图7）。

4 讨论

根据PCR/RT-PCR检测，可以确诊该送检发病猪除感染有PRRSV外，CSFV也呈阳性，据述该猪群近期先后做了2次猪瘟疫苗免疫，因此该CSFV系疫苗毒的可能性较大。结合病理剖检和检测结果，病猪发病与PRRSV相关性较大，PRRSV为免疫抑制性病原，猪只感染后免疫调节受到抑制，导致机体对其他病原体的抵抗力降低，自身免疫调节能力极度下滑，继而出现多种病毒或细菌的混合感染情况。根据发病猪解剖病症以及细菌的初步染色镜检结果可知，发病猪同时还存在副猪嗜血杆菌和链球菌的感染。副猪嗜血杆菌病主要导致肺脏、胸腔和关节浆膜出现纤维素性炎症，临床特征为咳喘、呼吸不畅、体态消瘦、皮毛粗乱[5]，在养猪业饲养管理过程如CSFV和PRRSV等病毒感染或是饲养管理不当等因素均可诱发该病的发生。猪链球菌病和副猪嗜血杆菌病是现代规模化养殖中常见的两种细菌性传染病，通过呼吸与排泄物感染各个阶段的猪只，链球菌病最早发生在仔猪10日龄左右，而副猪嗜血杆菌病在仔猪断奶后逐渐显现，两者相互促进使其对猪只的危害加深[6]。

对于该猪场CSFV、PRRSV、副猪嗜血杆菌和猪链球菌多病原感染的情况，应制定科学的免疫程序，对猪只进行猪瘟兔化弱毒疫苗和PRRSV疫苗的免疫接种，并且对 CSFV和 PRRSV的抗体进行定期监测，严格控制病毒的感染及蔓延，以降低危害，对于猪瘟感染的情况可用猪瘟血清抗体，硫酸庆大霉素进行肌肉注射或静射，1次/d，持续3 d，对于重症猪，要及时治疗[7]。PRRS和 CSF目前尚无特治疗效药，但可以通过疫苗接种进行预防，以减少其带来的危害，在饲料中添加适当的抗菌药物以防止猪群的继发性感染，在哺乳仔猪在断奶前后，可饲料中添加适量的黄芪多糖和抗生素，以提高猪只自身免疫力和抵抗力，以预防猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征继发的细菌性感染。预防副猪嗜血杆菌和猪链球菌的感染，应适当降低饲养密度、减少温度差异等环境可能带来的应激因素，注重药物保健，在饲料中添加适量的抗菌药物[8]，同时要强化饲养管理，尤其是圈舍要经常性消毒，保持通风和环境干燥，在购进猪只隔离期间，消毒工作不能懈怠，在饮水中可适量添加电解多维，饲料中可添加氟苯尼考或替米考星等药物进行保健7 d以上，并及时监测猪群疫苗免疫水平，适时做好相关疫苗的有效免疫。

图6 细菌革兰氏染色结果

图7 细菌PCR检测结果