原子力显微镜实时观测磷脂膜上糖脂簇诱导Aβ的聚集

邵贺云， 张明曦*， 沈 雷， 夏 君， 李 勇， 孙涛垒*,

(1.武汉理工大学材料复合新技术国家重点实验室，湖北武汉 430070； 2.武汉理工大学化学化工与生命科学学院，湖北武汉 430070； 3.中南民族大学生命科学学院，湖北武汉 430074)

β淀粉样蛋白(Amyloidβ，Aβ)和许多神经退行性疾病的发病机理有关[1 - 2]，研究者在阿尔兹海默症病人的大脑老年斑上发现了聚集的Aβ，而其聚集对阿尔兹海默症的发病有着重要的影响[3]。活体生物细胞中，Aβ(1-40)的生理学浓度是10-8mol/L，远远低于其临界自聚集浓度(17.5～100 μmol/L)[4 - 5]，然而在病理条件下Aβ(1-40)仍然可以发生聚集，表明生物体内很有可能存在某种机理或某种元素可以降低Aβ(1-40)在聚集过程中所需要的能垒，进而促成Aβ(1-40)的纤维化[6]。相比于体外溶液，Aβ实际存在于有着高浓度蛋白、脂质膜、糖的活体细胞环境中，并易在由糖脂、鞘磷脂(Sphingomyelin，SM)和胆固醇(Cholesterol，Chol)组成的高度有序的脂质微区上聚集[7]，通过吸附到分子界面上，尤其是吸附到细胞膜上，Aβ的有效浓度会被极大增强。越来越多的证据显示活体分子界面[8]，例如活体细胞膜对蛋白聚集具有重要影响，并且细胞界面的组成元素和结构也极大影响着淀粉纤维形成的动力学进程[9 - 10]。生物化学研究中经常用支撑脂质双层膜(Supported Lipid Bilayers，SLBs)模拟细胞膜，探究生物膜的性质和生物进程，例如分子识别、膜融合、纤维形成等[11]。这些表面能够为蛋白质提供连接位点，增大蛋白质的浓度和分子链的彼此作用，加速蛋白纤维化。

神经节苷脂是鞘糖脂的一种，分布在脊椎动物等离子体膜的外层。其中单唾液酸神经节苷脂糖脂(Monosialoganglioside,GM1)被很多学者认为和Aβ的聚集有关[12 - 13]。研究发现，正常人体脑脊液中GM1的浓度是30 nmol/L，高于阿尔兹海默症患者脑脊液中GM1的浓度(10 nmol/L)，考虑到很有可能是患病的细胞释放了GM1[14]，研究人员便提出GM1可能作为胶束核引发Aβ的聚集[15]。Yanagisawa等[16]在阿尔兹海默症患者的脑中检测到Aβ-GM1的混合物，表明两者的结合物很有可能是引发Aβ聚集的种子。Matsuzaki等人[17 - 18]也提出GM1团簇对Aβ的聚集有着至关重要的作用，指出Aβ易于和GM1团簇连接[19]。Fernández-Pérez等人[20]通过研究发现GM1对Aβ和膜的连接至关重要。与此同时，Matsubara等人对Aβ在糖脂膜上的聚集进行原子力显微镜(Atomic Force Microscopy，AFM)表征[21]。然而现在的研究并未对GM1团簇如何引发Aβ聚集进行原位、高分辨的观察。本文利用AFM，在液相模式下对SLBs上GM1簇诱导Aβ(1-40)纤维化进行了实时高分辨成像，发现Aβ会在GM1簇上发生聚集，并且Aβ纤维以GM1簇为联结位点生长。通过AFM观测Aβ如何在GM1簇上聚集，将会帮助我们更为直观深入的了解蛋白纤维化，促进阿尔兹海默症病理的研究，为阿尔兹海默症的治疗提供更多的可能。

1 实验部分

1.1 主要仪器及试剂

FastScan原子力显微镜(德国，Bruker公司)；纳米粒度及Zeta电位分析仪(德国，Malvern公司)；Jasco J-1500 圆二色谱仪(日本，分光公司)；610020迷你挤出机(美国，Avanti Polar Lipid公司)。

鞘磷脂(SM，美国Avanti Polar Lipid)，纯度>99%；胆固醇(Chol，美国Avanti Polar Lipid)，纯度>99%；单唾液酸四己糖神经节苷脂GM1(美国Sigma)，纯度>95%；β淀粉样肽(1-40)(美国Invitrogen)，纯度>99%。

1.2 实验条件

1.2.1脂质体的制备脂质体溶液是制备支撑平面双层膜的前提，而脂质体粒径大小和粒径分布状态对后续的脂质膜制备将会产生很重要的影响。脂质体的制备方法有很多种，本实验利用先超声法后挤出法制备脂质体。将脂质组分(SM、Chol和GM1)分别溶解于氯仿-乙醇(2∶1，V/V)溶剂中，最终浓度分别为1 mg/mL、1 mg/mL和0.5 mg/mL，并将溶解好的溶液置于冰箱-20 ℃保存，待用。

取上述400 μL的SM溶液、200 μL的Chol溶液和126 μL的GM1溶液注入圆底烧瓶中，用N2吹干。将圆底烧瓶置于真空干燥箱中，于33 ℃下抽真空2 h，再将其密封，放置过夜。取5 mL 0.01 mol/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.4)于烧瓶中，加入磁子，在60 ℃的恒温油浴中磁力搅拌2 h，调整油浴锅转速1 500 r/min，随后冷水浴超声30 min。取上述悬浮液在挤出机上进行挤出，设置挤出温度为60 ℃，挤出次数在16次以上。

1.2.2含有GM1簇的SLBs的制备SLBs以云母作为基底，采用脂质体直接融合技术制备。滴加制备好的100 μL的脂质体悬浮液到新鲜剥离的云母基底上，并在60 ℃条件下加热孵育60 min。将样品缓慢冷却至室温，再用缓冲溶液去除多余的脂质体，边用缓冲溶液冲洗云母片边吸取冲洗下的未溶解的脂质体溶液，重复以上萃取操作5次以上。将冲洗过后的样品放置在样品台上，并加缓冲溶液于样品表面，防止样品去湿。

1.2.3AFM样品的制备洗涤萃取程序后，将上述制备的含有GM1簇的SLBs放置在浓度为1 μmol/L的Aβ溶液中进行孵育，孵育温度37 ℃，标定好时间，随后对孵育过的样品进行实时液相观察。成像前，样品要在PBS中平衡15～25 min，先在低分辨率下观察，再在高分辨率下观察。

1.2.4AFM液相观察在室温下使用AFM以液相流体模式对样品进行原位观测。通过使用具有0.35N/m 的额定弹簧常数的氮化硅DNP探针，以1～2 Hz的扫描速率在ScanAsyst模式下记录图像。悬臂振荡频率为2 kHz，扫描力被调整到最小值(0.5 nN)。所有图像在512×512像素扫描下采集，并通过Nanoscope -Ⅲ软件分析。

1.2.5纳米力学性质测量杨氏模量数据通过PeakForce QNM(Quantitative Nanomechanical Property Mapping)定量纳米力学性质成像模式获得，该模式能在对样品成像同时映射DMT(Derjaguin，Muller，Toropov)模量。其中反映样品硬度的杨氏模量与DMT模量有关，可以按照公式(1)计算[10]。

(1)

其中，e0是DMT模量，e1和e2分别代表样品和针尖的杨氏模量，v1和v2分别代表样品和针尖的泊松比，令e2=395 GPa，v1=0.5，v2=0.27。实验样品中不同的相会具有不同的刚度，因此可以根据杨氏模量的大小来表征和鉴定样品中不同相的形成。

产品质量保障能力是企业对产品质量和质量事故监测，以及质量事故和风险控制的能力。从产品质量生产过程和售后服务角度来看，即企业是否建立相应保障机制，监测质量状况和识别质量风险，及时解决潜在的质量风险，对已经发生的事故进行分析，避免类似批次性质量问题的再发生。由此可见，产品质量保障能力包括计量管理水平、认证管理水平、质监部门监督抽查状况、质量事故记录情况、市场反馈及投诉记录情况、产品质量获奖情况等内容。

1.2.6CD测量将Aβ(1-40)溶液分别和SM/Chol/GM1悬浮液、SM/Chol悬浮液混合，混合液中的Aβ(1-40)的浓度为10 μmol/L)，37 ℃孵育，随后进行CD测量。CD测量温度为37 ℃，为了将由缓冲溶液组分引起的光吸收最小化，本实验使用1 mm石英池；缓冲溶液的空白谱图作为背景被扣除；每个样品平均扫描8次。

2 结果与讨论

2.1 SLBs上GM1簇的生成

图1展示的是GM1簇在制备的SLBs(SM/Chol/GM1)上形成的AFM图像。其中SM/Chol二元体系脂质体溶液粒径和SM/Chol/GM1三元体系脂质体溶液粒径分别为68.2 nm、78.8 nm。如图1a和图1c所示，可以看到利用SM/Chol脂质体溶液和SM/Chol/GM1脂质体溶液制备脂质膜，两者都形成了液相有序膜，SLBs的厚度为4.3±0.3 nm(图1b和图1d)，并且在SM/Chol/GM1三元混合体系制备的脂质膜上，明显出现了大小不等的圆形GM1簇(图1c)，圆形簇的高度为1.2～2.5 nm，粒径41～290 nm(图1d)。

图1 (a)SLBs(SM/Chol)的AFM图像；(b)对应于图a白线处的横截面图；(c)SLBs(SM/Chol/GM1)的AFM图像；(d)对应于图c白线处的横截面图Fig.1 (a)AFM image of SLBs(SM/Chol);(b)Cross-sectional profile along the white line in(a);(c)AFM image of SLBs(SM/Chol/GM1);(d)Cross-sectional profile along the white line in(c)Scale bar is 200 nm.

图2 (a)SLBs(SM/Chol/GM1)的AFM图像；(b)对应的DMT模量图；(c)标注1处的杨氏模量；(d)标注2处的杨氏模量Fig.2 (a)AFM image of SLBs(SM/Chol/GM1);(b)Corresponding DMT modulus mapping image；(c)Calculated Young’s modulus of region 1;(d)Calculated Young’s modulus of region 2The scale bar is 200 nm.

为了进一步证明GM1簇的形成，对加入GM1后的脂质膜进行了DMT模量的测量，随后进行了杨氏模量的计算。杨氏模量的表征结果如图2所示，通过图2a我们可以清楚的看到GM1簇较好的分散在脂质膜上，分别选择两个区域，区域1(SLBs)和区域2(GM1簇)，并通过DMT模量对这两个区域的杨氏模量进行换算，计算结果如图2c和2d所示。结果显示区域1(SLBs)杨氏模量为1.892 MPa，区域2(GM1簇)的杨氏模量为1.084 MPa，可以明显的看出GM1簇的杨氏模量不同于SLBs的杨氏模量，说明SLBs上确实有新的结构即GM1簇生成。驱使GM1形成团簇的作用力主要是GM1分子内部的氢键受体和供体之间的相互作用，包括GalNAc、Neu5Ac和Gal，通过这些头部基团的彼此作用，越来越多的GM1联合在一起，最终形成不同于SLBs区域的团簇状GM1簇[22 - 23]。SLBs是通过复杂疏水作用形成的高度有序结构，而构成GM1簇的主要作用力是氢键作用力，相比而言GM1簇形成的作用力要远远小于构成SLBs的作用力，因此GM1簇的杨氏模量小于脂质双层膜的杨氏模量。

2.2 Aβ纤维化的形成

2.2.1CD谱分析为了检测GM1对Aβ的影响，利用CD测试了Aβ(1-40)与脂质体悬浮液在37 ℃孵育一定时间后的构象转变。图3a和图3b，对应的是浓度为10 μmol/L的Aβ(1-40)分别与脂质体悬浮液(SM/Chol/GM1)、脂质体悬浮液(SM/Chol)在37 ℃孵育后的CD谱图。我们可以清楚的看到，在脂质体悬浮液(SM/Chol/GM1)中，最初Aβ(1-40)分子出现典型的峰值在208 nm处的α螺旋峰(图3a曲线1)，随着孵育时间延长至25 h，α螺旋峰消失，随之在218 nm附近出现了峰(图3a曲线4)，表明Aβ(1-40)逐渐从α螺旋构象转变成β片层构象；然而Aβ(1-40)与脂质体悬浮液(SM/Chol)孵育后却没有出现构象转变的现象(图3b)，孵育25 h后的CD谱曲线基本和起初的曲线相似，始终没有出现β片层构象。这样的结果表明GM1的确能够加速Aβ(1-40)的构象转变。

图3 10 μmol/L Aβ和脂质体悬浮液SM/Chol/GM1(a)及脂质体悬浮液SM/Chol(b)在37 ℃ 孵育后的CD谱图 Fig.3 CD spectra of 10 μmol/L Aβ incubated with SM/Chol/GM1(a) and SM/Chol(b) at 37 ℃

2.2.2AFM图像分析图4展示的是由SM/Chol/GM1制备的SLBs(图4a)和由SM/Chol制备的SLBs(图4b)，分别在浓度为1 μmol/L的Aβ溶液中孵育30 h后的AFM图像，通过观察可以发现，将SLBs(SM/Chol/GM1)孵育在浓度为1 μmol/L的Aβ(1-40)溶液中30 h后，有长条Aβ纤维形成，该Aβ纤维贯穿几个GM1簇，并且纤维只形成在有GM1簇的区域，然而将SLBs(SM/Chol)孵育在1 μmol/L的Aβ(1-40)溶液中30 h，却并没有观察到任何纤维化的状态，由此可以看出GM1簇对Aβ的纤维化有着至关重要的作用，GM1簇的存在是Aβ纤维化的关键。

图4 1 μmol/L Aβ(1-40) 溶液与SM/Chol/GM1(a)及SM/Chol(b)37 ℃ 恒温孵育30 h的AFM图 Fig.4 AFM images of Aβ(1-40) incubated with SM/Chol/GM (a) and SM/Chol (b) at 37 ℃ for 30 h The scale bar:200 nm.

2.3 Aβ纤维化的影响因素

2.3.1孵育时间图5展示了液相下Aβ(1-40)在SLBs上的纤维化进程，其中图a～e展示的是不同时间点Aβ纤维化的AFM图像，图f展示的是对应不同时间点观察到的纤维长度。通过观察可以发现，当孵育时间为17 h时(图5a)，支撑脂质膜上并没有Aβ纤维；但是当孵育时间延长至20 h时，支撑脂质膜上便出现了豆芽状的Aβ纤维，并且该纤维以GM1簇为形成位点，如图5b所示，此时纤维长度约81 nm；当孵育时间为22 h时，纤维进一步长大，长约130 nm(图5c)；当孵育时间为25 h时纤维长大成棒状，贯穿1～2个GM1簇(图5d)，此时纤维长度约520 nm；随着孵育时间延长至32 h，Aβ纤维的长度进一步增大至1350 nm，并且此时Aβ纤维贯穿的GM1簇的数目也进一步增多(图5e)。上述结果表明，Aβ纤维化的进行需要相对长的时间在GM1簇上开始聚集，一旦开始发生聚集，纤维便迅速生长。Aβ纤维只出现在含有GM1簇的位点上，并且以GM1簇位点为生长点，随着Aβ纤维的长大，Aβ纤维贯穿的GM1簇的数目也随之增多。

图5 SLBs(SM/Chol/GM1)在1 μmol/L Aβ(1-40)溶液中在37 ℃孵育后的AFM图像及不同时间Aβ长度Fig.5 AFM images of SLBs(SM/Chol/GM1) after incubated in 1 μmol/L Aβ(1-40) at 37 ℃ for 17 h(a),20 h(b),22 h(c),25 h(d),32 h(e) and (f) the length of Aβ fibrils at different time The scale bar is 200 nm.

2.3.2GM1簇的密度通过实验我们还发现，除了孵育时间，SLBs上GM1簇的密度同样会影响Aβ纤维化的进程。如图6所示，将SLBs和Aβ(1-40)在37 ℃温度条件下孵育30 h，通过观察SLBs的不同区域，我们发现Aβ纤维的长度和GM1簇的密度紧密相关。当SLBs上GM1簇的数量很少时，几乎不能观察到纤维的形成，如图6a；随着SLBs上GM1簇密度的增大，形成的Aβ纤维的长度也随之增大，如图6b和6c所示，可以明显地看到在GM1簇密度较大的区域，Aβ纤维贯穿多个GM1簇生长，说明GM1簇密度会影响Aβ的生长长度。当SLBs上GM1簇的密度较大时，充足的GM1簇很有可能增大了Aβ和GM1簇相互作用的机率，因而SLBs上越多GM1簇存在的区域，形成的纤维就越长。

图6 SLBs(SM/Chol/GM1) 在1 μmol/L Aβ(1-40) 溶液中在37 ℃ 孵育30 h后不同区域AFM图像Fig.6 AFM images of different areas of SLBs(SM/Chol/GM1) after incubated in 1 μmol/L Aβ(1-40) at 37 ℃ for 30 hThe scale bar is 200 nm.

通过观察AFM图片还可以发现，Aβ纤维并不是随机的分布在SLBs上，而是串联通过多个GM1簇，即GM1簇不仅能够促进Aβ分子发生聚集，同样能够作为Aβ纤维增长的联结位点。

2.3.3SLBs的面积通过讨论GM1簇的密度对Aβ纤维化的影响，我们知道GM1簇能够引发Aβ分子发生聚集并作为Aβ纤维增长的联结位点，因此可以猜想影响GM1簇生成的因素很有可能间接的影响Aβ纤维化。通过观察图7，我们可以发现当云母基底膜覆盖率较低时，GM1簇的生成率也会下降，图7b和7c展示的分别为出现少量的GM1簇、未出现GM1簇的支撑脂质膜的AFM图像，图7b、c相比于图7a，脂质膜覆盖率较低，而只有脂质膜覆盖率高的图7a出现了较多的GM1簇和Aβ纤维。

图7 覆盖率不同SLBs(SM/Chol/GM1)在1 μmol/LAβ(1-40)溶液中在37 ℃孵育30 h后的AFM图像Fig.7 AFM images of SLBs (SM/Chol/GM1) with different coverage after incubating in 1 μmol/L Aβ(1-40) at 37 ℃ for 30 hThe coverage of SLBs in Fig.7a,7b,7c is high,medium,and low,respectively.The scale bar is 600 nm.

从以上实验结果我们可以猜测，SLBs的大小会对纤维的形成产生影响，很有可能是通过影响GM1簇的形成引起的，较大的膜面积在一定程度上增大了GM1分子和脂质膜的组分接触的机会，增大了GM1簇在膜上形成的可能性，结合图6我们已经知道GM1簇的密度会影响纤维的形成和长度，因此可以说SLBs面积的大小对纤维的形成会产生间接的影响。

3 结论

本文在生成GM1簇的脂质膜体系(SM/Chol/GM1)中加入Aβ，观察到了Aβ纤维化现象。通过AFM实时高分辨的观测发现，Aβ的纤维化不是随机发生，而是以GM1簇为联结位点进行增长；通过CD确认了GM1能够加速Aβ的构象转变，进而诱导Aβ分子的聚集，促进纤维化的进行；此外，Aβ的纤维化与孵育时间、GM1簇的密度、SLBs的大小密切相关，其中Aβ纤维出现的时间大约为20 h，且随着孵育时间的增加，纤维长度逐渐增长，最后纤维可贯穿多个GM1簇，并且GM1簇的密度会影响Aβ纤维的生长和长度。以上工作将有助于我们更直观的了解蛋白纤维化的方式，启发我们可以通过阻止GM1簇的形成，进而控制Aβ的纤维化，为阿尔兹海默症的预防和治疗提供更多的可能。