5-甲基-2-(2′-吡啶基)苯并咪唑及甘氨酸根铜Ⅱ配合物的合成、DNA结合及抗癌活性

莫慧雯 刘雅娴 蔡戴宏 沈 芳 乐学义

(华南农业大学材料与能源学院应用化学系，广州 510642)

铜是人体内必需的生命元素，作为结构和催化辅助因子参与机体内许多生命过程，并且其配合物在氧化还原环境中有着可调控的配位构型，在细胞水平能得到更好的利用，因此常常作为药物分子尤其是抗肿瘤药物分子的基本结构单元[1-2]。芳杂环化合物具有生物分子中咪唑、嘌呤碱和嘧啶碱等基团类似的配位性质，并且具有潜在的杀菌、抗氧化、抗病毒和抗肿瘤等生物活性，尤其是当与生命元素形成配合物时通过协同作用可进一步提高其生物活性[3-4]。氨基酸为重要的生物配体，具有很好的生物兼容性和潜在的生物活性(如抗氧化、抗肿瘤等)及识别生物大分子的功能，作为配体不仅有助于提高配合物的生物活性，而且能够改善配合物在溶液中的溶解性，提高其生物利用率，降低其毒副作用等[5-6]。

基于以上考虑，本研究设计、合成和表征了新的三元铜Ⅱ混配配合物[Cu(HPBM)(Gly)(H2O)]ClO4·0.5H2O(其中 HPBM=5-甲基-2-(2′-吡啶基)苯并咪唑，Gly=甘氨酸根)。研究了配合物与DNA的作用及其抗肿瘤活性，探讨了其作用机制。

1 实验部分

1.1 主要材料和仪器

小牛胸腺DNA(CT-DNA)购自华锐试剂有限公司，生物纯；细胞毒性实验所用试剂或试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，生物纯；其它试剂均为市售分析纯；食管癌细胞(Eca-109)、人宫颈癌细胞(HeLa)和人肺癌细胞(A549)等细胞系来自于中山大学实验动物中心。整个试验过程使用的水均为去离子水。

所用仪器有：河南巩义仪器有限公司DDS-11A数显电导率仪；美国Nicolet公司ACATAR 360 FTIR型红外光谱仪；德国ELEMENTAR公司Vario EL元素分析仪；日本Shimadzu公司Pharmacia UV-2550紫外-可见分光光度计；日本岛津RF-5301荧光光谱仪；上海晶菱玻璃有限公司乌氏粘度计；瑞士Tecan公司Infinite M200 pro多功能酶标仪；北京六一仪器厂JY200C电泳仪；意大利Laboratories-Segrate BIO-RAD凝胶成像系统；美国Thermo公司Scientific Forma CO2细胞培养箱；德国LEICA公司DMI3000B正置荧光显微镜；美国BD Bioscience公司FACSCalibur流式细胞仪。

1.2 常用溶液的配制

Tris-HCl/NaCl缓冲溶液(pH=7.2)：0.005 mol·L-1三羟甲基氨基甲烷(Tris)+0.05 mol·L-1NaCl。0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH=7.4)：2.68 mmol·L-1KCl+0.138 mol·L-1NaCl+1.76 mmol·L-1KH2PO4+0.01014 mol·L-1Na2HPO4。0.012 mol·L-1噻唑蓝(MTT)溶液：用 0.01 mol·L-1PBS配制。配好后置于4℃下避光保存，储存时间不超过1周。CT-DNA溶液：用Tris-HCl/NaCl缓冲溶液配制。配制好后测得A260/A280比值介于1.8～1.9之间，表明溶液中基本不含蛋白质， 且浓度以 ε260=6 600 L·mol-1·cm-1确定[7]。 CTDNA溶液放置在4℃冰箱内保存，且储存时间不超过3 d。

1.3 配合物的合成

首先，参照文献方法[8]制备配体HPBM。

配合物合成具体过程如下：称取HPBM(0.5 mmol，0.052 3 g)于20 mL无水甲醇中，待其完全溶解后加入1 mL 0.5 mol·L-1Cu(ClO4)2溶液，加热搅拌得到草绿色澄清液A；然后称取甘氨酸(0.5 mmol，0.0188 g)溶于4 mL去离子水中，再加入1 mL的0.5 mol·L-1NaOH溶液，得到B液；将B液缓慢滴加到A液中，加热搅拌回流1 h后自然冷却到室温，过滤、静置自然挥发，2周后得到墨绿色粉末态沉淀物。将过滤得到的固体粉末用甲醇重结晶，获得的固体产物空气干燥后密封保存。元素分析按CuC15H18N4O7.5Cl 计 算 值 (%)：C，38.07；H，3.80；N，11.84。实验值(%)：C,37.86；H，3.86；N，11.72；IR(KBr，cm-1)：3 438(s，br)，3 311(w)，3 149(w)，1 612(s)，1 492(s)，1 398(s)，625(w)，432(w)；UV-Vis(甲 醇 为 溶 剂 )，λ/nm(ε/(L·mol-1·cm-1))：207(46 512)，348(21 262)，626(65.35)；MS(甲 醇为 溶 剂)：m/z=345.9 对 应 于[Cu(HPBM)(Gly)]+； 电导率测定(甲醇为溶剂)：Λ=104.2 S·cm2·mol-1。

1.4 配合物与DNA相互作用实验

1.4.1 电子吸收光谱滴定实验

在空白池和样品池中分别加入3 mL Tris-HCl/NaCl缓冲溶液和50 μmol·L-1配合物溶液， 用紫外分光光度仪检测在200～450 nm波长范围内电子吸收光谱，随后依次往空白池和样品池中分别加入等体积的2 mmol·L-1CT-DNA溶液，使CT-DNA与配合物的浓度比值不断增加。每次加入CT-DNA溶液并静置5 min后，在上述同样波长范围内进行扫描。

1.4.2 荧光猝灭光谱测定

将等体积(2.5 mL)的 8 μmol·L-1溴化乙啶(EB)与10 μmol·L-1CT-DNA溶液混匀，放置2 h使 EB与CT-DNA充分作用。往样品池中加入3 mL的EB-CT-DNA混合溶液，设定好相关参数值：激发波长为525 nm，扫描速度为240 nm·s-1，扫描波长范围540～700 nm。然后，用移液枪依次往EB-CT-DNA体系中滴加1 mmol·L-1配合物溶液20 μL，使配合物浓度不断增加。每次待其反应5 min后测定其荧光发射光谱。

1.4.3 粘度测定

粘度测定试验参照我们以前报道的方法进行[9]。

1.4.4 分子对接

使用Gaussian viewer软件画出配合物的分子结构，并采用Gaussian 09软件进行几何构型优化，优化后得到的配合物分子结构文件用于分子对接。DNA结构文件来自PDB数据库(PDB ID：6BNA)。整个分子对接过程在AutoDock4.2软件[10]上进行，格点间隔为0.037 5 nm，格点中心坐标为：x=24.986、y=9.578、z=20.079，格点大小为 60×60×60，采用经典拉马克遗传算法 (Lamarckian genetic algorithm，LGA)，计算轮数为100，其他参数保持默认设置。配合物分子和DNA分子间的能量匹配用半经验的自由能计算方法进行评价[11]。计算结果使用Autodock 1.5.6软件进行分析并运用PyMol软件进行可视化处理[12]。

1.5 配合物细胞毒性试验

1.5.1 MTT实验

试验细胞用RMPI-1640培养基培养，复苏后的细胞接种于50 cm3培养瓶中进行培养，收集对数生长期的细胞接种于96孔板中，细胞密度为每孔8×103～1×104个之间，将该板放置于含 5%(V/V)CO2的37℃无菌培养箱中，待细胞贴壁并长至85%时进行加药处理。每种试验药物设置7个浓度，其浓度变化范围为 1.57～100 μmol·L-1，每个样重复 3 次，并使用顺铂作为阳性对照。加药孵育48 h后，除去孔中上清液，每孔加入100 μL二甲基亚砜，缓慢振荡10 min使蓝色甲瓒溶解完全，使用多功能酶标仪测定96孔板各孔在490 nm处的吸光度值，记录并处理分析结果。

1.5.2 AO/EB双重荧光染色法

将1×105个细胞接种于6孔板中，培养24 h后除去培养基，然后加入新的RPMI-1640培养基和一定浓度的试验药物化合物，设置空白组和加药组，孵育24 h后除去培养液，用PBS清洗2次，加入吖啶橙(AO)/溴化乙锭(EB)混合染色液(100 μg·mL-1AO，100 μg·mL-1EB)染色，置培养箱中避光作用 15 min后，再用PBS清洗掉细胞表面残留的染色液，使用荧光显微镜观察细胞的形态并进行拍照 (全程尽量避光)。

1.5.3 单细胞凝胶电泳试验

将处于对数期的Eca-109细胞接种于6孔板中，每孔约35万个细胞，置于5%(V/V)CO2培养箱中培养24 h后，再加药物化合物并放入培养箱继续培养24 h。将培养板取出并弃去培养液，用PBS冲洗掉残余的培养基和细胞碎片，再加入胰蛋白酶进行消化，待消化完全后加入等量的无血清RPMI-1640培养基，以800 r·min-1转速离心5 min后倒掉上清液，然后添加PBS至细胞悬浮液浓度约为2×105mL-1。

用PBS配制0.5%正常熔点琼脂糖凝胶(NMA)置于56℃水浴中恒温备用，同时用该缓冲液配制0.5%和1.0%低熔点琼脂糖凝胶(LMA)置于38℃水浴中恒温备用。取100 μL 0.5%正常熔点琼脂糖凝胶铺于载玻片上并放上盖玻片，置于4℃冰箱中冷却10 min作为第一层胶；去掉盖玻片，取50 μL上述细胞悬浮液与50 μL 1.0%低熔点琼脂糖凝胶混合均匀后立即铺于第一层胶上，放上盖玻片并置于冰箱中冷却10 min；再取100 μL 0.5%低熔点琼脂糖凝胶铺于第二层胶上，同样放上盖玻片置于冰箱中冷却10 min，至此制得三层胶板。将制得的胶板放入4℃碱性细胞裂解液中裂解2 h，紧接着用蒸馏水冲洗掉胶面上的碱性裂解液，再置于电泳槽中电泳20 min(25 V，300 mA)。电泳结束后，用冰水清洗胶板 10 min，再用 20 μL EB 溶液(20 μg·mL-1)在避光条件下作用20 min，最后用水清洗胶板后上机进行检测。

1.5.4 线粒体膜电位变化检测

以每孔约2×105个处于对数期生长的Eca-109细胞接种于12孔板，置于5%(V/V)CO2培养箱中培养孵育过夜，待细胞贴壁并长至80%左右加入相应药物化合物继续孵育。作用24 h后，吸弃旧培养液，用PBS清洗2次，每孔加入1 mg·mL-1荧光探针JC-1，在37℃干燥箱中避光孵育30 min。最后，用PBS清洗并立即上机检测，全程尽量避光。

1.5.5 细胞周期检测

将每孔约4×105个 Eca-109细胞接种于 6孔板，置于5%(V/V)CO2培养箱中培养过夜，再加入一定浓度的药物化合物孵育24 h。弃掉残余培养液，用PBS清洗2次后加入15 μL 0.2 mg·mL-1核糖核酸酶(RNAse)和 15 μL 0.02 mg·mL-1碘化丙啶(PI)并避光放置30 min，最后使用流式细胞仪检测处于各个期的细胞百分数。

2 结果与讨论

2.1 配合物的表征

在配合物红外光谱中，3 438 cm-1处强吸收峰归属于水的-OH伸缩振动；3 311和3 149 cm-1处吸收峰分别归属于-NH2的不对称伸缩振动和对称伸缩振动；1 750～1 700 cm-1范围内没有吸收带，表明甘氨酸根参与了配位[13]；1 612和1 392 cm-1处吸收峰分别为-COO-的不对称伸缩振动和对称伸缩振动，且 Δν=νas-νs＞200 cm-1，表明甘氨酸根中-COO-为单齿配位基团；1 492 cm-1处尖锐的吸收峰可归属于芳杂环配体上的C=N伸缩振动；625和432 cm-1处的吸收峰可归属于Cu-O和Cu-N的伸缩振动[14]。

在配合物甲醇溶液紫外可见光谱中，207和348 nm处2个较强的吸收峰归属于配体的π→π*跃迁，并且与自由配体HPBM相关吸收峰相比，配合物吸收峰均发生了红移 (202→207 nm，317→348 nm)，且吸收强度减弱，证实了HPBM参与配位；626 nm处弱而宽的吸收峰归属于中心离子Cu2+的d→d跃迁,表明配合物分子可能具有变形四方锥结构[15]，即具有5个配位原子。

配合物元素分析结果表明，实验值与理论计算值一致。而配合物甲醇溶液质谱中存在[Cu(HPBM)(Gly)]+离子峰，进一步证实了HPBM及Gly与Cu2+配位。另外，测得配合物在甲醇溶液的摩尔电导率值为104.2 S·cm2·mol-1，表明配合物为 1∶1 型电解质[16]，高氯酸根未参与配位。结合上述配合物紫外可见光谱分析结果，可推测有一水分子参与配位。

据上述元素分析、红外光谱、紫外可见光谱、质谱及摩尔电导率等测定结果，并参照类似配合物[Cu(pbt)(Gly)(H2O)]ClO4[17]研究结果，可合理地推测标题配合物分子式为[Cu(HPBM)(Gly)(H2O)]ClO4·0.5H2O，可能的分子结构如图所示：

图1 配合物可能的分子结构Fig.1 Possible molecular structure of the complex

2.2 配合物与DNA的作用

2.2.1 配合物与DNA作用的电子吸收光谱

在研究小分子化合物(配合物)与DNA的作用中，电子吸收光谱是最常用的方法之一。可以通过DNA滴定过程中配合物电子吸收光谱吸收峰的减色或增色、红移或蓝移等现象初步判断配合物与DNA的结合模式。配合物的电子吸收光谱滴定实验如图2所示。

图2 配合物在不同CT-DNA浓度下的电子吸收光谱图Fig.2 Electronic absorption spectra of the complex upon addition of CT-DNA

结果表明，随着CT-DNA浓度增加(图中箭头指向)，配合物在342 nm处具有比较弱的减色性，最后趋于稳定，且吸收峰位置未出现明显的移动，由此推测配合物对CT-DNA具有部分插入作用且较弱。此外，根据滴定过程中配合物光谱吸收带强度的变化，应用下列方程式可获得配合物与CT-DNA的结合常数Kb[18]：

式中 cDNA为 CT-DNA 的浓度，εa、εb和 εf分别表示与CT-DNA完全结合后配合物的摩尔吸光系数及自由配合物的摩尔吸光系数。以cDNA/(εf-εa)对cDNA作图，则斜率与截距的比值为结合常数Kb。获得标题配合物与DNA的结合常数为7.26×104L·mol-1，比没有甲基取代的吡啶基苯并咪唑铜Ⅱ配合物[Cu(HPB)(Gly-L-val)(H2O)]ClO4的结合常数(3.21×105L·mol-1)小[19]，这可能主要归因于HPB环上引入甲基后产生了空间位阻，不利于配合物插入到DNA碱基对之间。

2.2.2 配合物与DNA作用的荧光猝灭

EB本身没有荧光性质，但当插入到DNA碱基对中时会产生强烈的荧光。通过将配合物溶液滴加到DNA-EB体系之后，测定体系荧光强度的变化并获得配合物的猝灭常数，进而可分析配合物与DNA的作用模式。标题配合物对EB-CT-DNA体系荧光猝灭作用如图3所示。可以看出，随着配合物浓度增加(图中箭头指向)，EB-CT-DNA体系的荧光强度逐渐减弱，表明配合物分子进入碱基对之间将EB挤出来并取代了其位置。另外，据Stern-Volmer公式[20]可计算出标题配合物对EB-CT-DNA体系的荧光猝灭常数KSV值：

其中I0和I分别表示未加入和加入配合物时EBDNA体系的荧光强度，r为配合物与DNA浓度的比值。获得配合物对EB-CT-DNA体系的荧光猝灭常数值为0.116 2，表明二者作用较弱，具有部分插入作用，与以上电子吸收光谱法测定结果一致。

图3 配合物对EB-CT-DNA体系荧光光谱的影响Fig.3 Effects of the complex on fluorescence spectra of EB-CT-DNA system

2.2.3 配合物与DNA作用的粘度实验

在缺少晶体学结构数据的情况下,粘度测定被认为是检测配合物与DNA结合模式最有效的方法[21]。加入配合物时，若DNA溶液粘度无明显变化，表明配合物以静电、沟槽等非插入模式结合；若DNA溶液粘度降低，表明配合物以部分插入的模式进行了结合；若DNA溶液粘度增大，则说明配合物以经典的插入模式结合。配合物对CT-DNA溶液粘度影响如图4所示。结果表明，随着配合物的加入，起初CT-DNA的粘度下降，但当配合物与CT-DNA的比例增加到一定程度(0.05)后粘度基本保持不变，由此推测配合物部分以插入模式作用，而大部分以沟槽结合方式与CT-DNA作用，与上述实验结果一致。

图4 配合物及EB浓度的增加对CT-DNA相对粘度的影响Fig.4 Effect of increasing amounts of the complex and EB on relative viscosity of CT-DNA

2.2.4 配合物与DNA作用的分子对接

由以上实验结果可推断配合物可能主要以沟槽结合方式与DNA结合。为进一步验证配合物与DNA之间相互作用的模式，我们使用DNA分子片段6BNA(PDB ID∶6BNA)进行了分子对接计算。得到的最低能量构象如图5所示。结果表明，配合物-DNA最稳定构象的结合能为-36.84 kJ·mol-1，配合物结合在DNA小沟处，并与邻近的碱基形成氢键(配合物：N4H13…6BNA∶DT-19∶O2(0.259 7 nm)，配合物：N4H13…6BNA∶DT-7∶O2(0.192 8 nm))，结合模式与上述粘度测量等实验方法获得的结果一致。另外，标题配合物与DNA结合的主要驱动力为范德华力，而氢键也是维持配合物与DNA复合物稳定性的重要因素。

图5 配合物与DNA(PDB ID:6BNA)分子对接最优构象Fig.5 Molecular docked model of the complex with DNA

2.3 配合物的体外细胞毒性

2.3.1 MTT实验

以顺铂作为阳性对照，应用MTT法测得配合物及配体 HPBM对所选细胞株 (Eca-109、HeLa和A549)的抑制活性(IC50值)如表1所示。由表1可见，配体HPBM细胞毒性较弱，但当与铜Ⅱ形成标题配合物后，其活性显著增强(提高10～20倍)，并与顺铂相当，表明配体与铜Ⅱ的协同作用对配合物的抗癌活性有重要影响。其中配合物对Eca-109细胞最为敏感、抑制作用最强，故以下选用Eca-109细胞对配合物的抗肿瘤作用机制进行探究。

表1 配体及配合物对细胞的IC50值Table 1 IC50values of HPBM and the complex toward selected cell lines

2.3.2 AO/EB染色法

采用AO/EB染色法观察配合物作用后Eca-109细胞形态的变化。其中，AO能分别透过活细胞和死细胞的细胞膜，与DNA结合呈现绿色荧光，而EB仅能在细胞膜受损时嵌入DNA呈现红色荧光。配合物对Eca-109细胞的诱导凋亡试验如图6所示。结果表明，与空白组实验a的细胞形态相比较，在配合物作用实验b中可观察到细胞收缩、细胞质凝结等现象，表明该配合物的加入能够诱导Eca-109细胞发生凋亡。

图6 配合物对Eca-109细胞的凋亡诱导实验Fig.6 Apoptosis induction experiment of Eca-109 cells by the complex

2.3.3 单细胞凝胶电泳结果分析

DNA作为生命的基础分子，其碎片化是细胞凋亡和有丝分裂的重要标志之一[22]。药物作用于细胞后，通过检测DNA的变化，可间接反映药物是否诱导细胞发生凋亡。单细胞凝胶电泳实验是一种在单细胞水平上检测DNA损伤的研究方法，因受损的细胞核在电场的作用下向正极移动，形成类似彗星的尾巴，故又称彗星实验。本文用配合物处理Eca-109细胞24 h后，测得其单细胞凝胶电泳如图7所示。从图中可见，对照试验(a)中的Eca-109细胞呈球体，而当有配合物作用(b、c)时有彗星拖尾现象，表明配合物的加入使Eca-109细胞中的DNA碎片化，从而进一步证明了标题配合物能诱导细胞凋亡。并且发现，随着配合物浓度增加(6.25→12.5 μmol·L-1)，彗星尾巴增长(b→c)，表明配合物浓度越高细胞DNA的损伤越严重。

图7 配合物与Eca-109细胞作用的单细胞凝胶电泳图Fig.7 Single cell gel electrophoresis of Eca-109 cells treated by the complex

2.3.4 线粒体膜电位检测结果分析

图8 配合物对Eca-109细胞线粒体膜电位影响的变化图Fig.8 Changes in the effect of the complex on the mitochondrial membrane potential of Eca-109 cells

文献报道，当线粒体膜电位丧失时，线粒体会通过释放促凋亡因子如细胞色素c和凋亡诱导因子进而导致细胞凋亡[22]。通常JC-1作为荧光探针可应用于检测线粒体膜电位变化，在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中而形成聚合物，将产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1为单体，将产生绿色荧光。因此可通过检测结果计算红色和绿色荧光的比例,进一步分析线粒体膜电位的变化趋势。配合物对Eca-109细胞线粒体膜电位的影响如图8所示。由图中可见，空白对照中红色和绿色荧光的比例为4.17，阳性对照(cccp：羰基氰化物间氯苯腙)中荧光比例为2.81，而配合物浓度为6.25和12.5 μmol·L-1时荧光比例分别为 3.84 和 2.95。结果表明配合物的加入导致线粒体膜电位丧失，并且配合物浓度越大膜电位丧失越大，从而揭示了标题配合物的抗癌活性与细胞线粒体功能失调有关。

2.3.5 细胞周期结果分析

已有研究发现，经药物作用后，将导致肿瘤细胞周期阻滞，进而DNA的合成被阻断而产生抗肿瘤作用[23]。本文应用流式细胞仪测定了配合物与Eca-109细胞作用后细胞的周期分布情况，如图9所示。结果表明，在 6.25 μmol·L-1配合物作用 24 h 后，Eca-109细胞S期和G2/M期分别由对照实验时的32.83%和16.39%增加到36.87%和17.73%，表明标题配合物能将Eca-109细胞阻滞在S期和G2/M期，其中S期增加的细胞较多 (4.04%)。因此，该配合物能使Eca-109细胞周期主要阻滞在S期。

图9 Eca-109细胞在对照实验 (a)及在6.25 μmol·L-1配合物作用后 (b)的细胞周期分布图Fig.9 Cell cycle distribution of Eca-109 cells in the control(a)and exposed to 6.25 μmol·L-1of the complex for 24 h(b)

3 结 论

合成、表征了新的 5-甲基-2-(2′-吡啶基)苯并咪唑的氨基酸铜Ⅱ配合物，并着重研究了配合物与DNA结合及其抗肿瘤活性。结果表明，配合物主要通过沟槽结合方式与DNA作用，对所选癌细胞具有显著的抑制作用(IC50＜10 μmol·L-1)，其中对 Eca-109细胞活性最强。并且以Eca-109细胞为研究对象，通过AO/EB双染法、单细胞凝胶电泳、线粒体膜电位及细胞周期测定分析，揭示了配合物通过DNA结合及线粒体途径诱导细胞凋亡。该研究结果对设计、合成新的铜Ⅱ配合物抗癌药物具有一定参考价值。