BCAR3、SCEL及LIFR mRNA在帕金森病患者血清胞外囊泡中异常表达

刘 郁，张静静，吕荣祥，王文盛

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种神经退行性疾病，主要表现为运动功能进行性减退，其发病机制与脑黑质或大脑基底神经节细胞死亡或功能异常有关[1]，且多数PD患者表现为神经元病理性蛋白质累积[2]。尽管如此，PD发生发展的分子机制仍未完全阐明，深入开展PD相关的分子标志物研究对于该病的早期诊断以及治疗研究至关重要。越来越多的证据表明，血清来源的胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性，因其稳定性好、不易降解、取材方便，可为疾病诊断、治疗及基础研究提供大量有价值的信息，已经成为多种疾病研究的热点[3]，但其在PD中的研究却十分有限。

本研究通过表达谱芯片分析了PD患者与健康个体血清EVs中mRNA表达差异，探索存在于PD患者血清EVs中新的异常表达基因，为PD相关的诊断和神经保护研究提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2016年1月～2017年11月于我院神经内科确诊的PD患者22例，健康对照个体16例。PD患者纳入标准：(1)符合2015年国际运动障碍协会的帕金森病诊断标准[4]；(2)无严重基础性疾病和其他内科合并症；(3)无精神类疾病，能够配合研究。排除标准：(1)由于药物、创伤或其他脑血管疾病等已知原因引起的继发性PD；(2)近期接受过药物治疗的PD患者；(3)早发性帕金森患者(起病年龄≤50岁)。本研究经宁波市第六医院伦理委员会批准，所有受试者均已签署知情同意书。

1.2 血清胞外囊泡提取、鉴定及RNA提取 收集受试者外周血5 ml，待血液凝固后3000 rpm离心10 min，小心将上清吸出备用。血清EVs及其RNA提取采用exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit试剂盒(QIAGEN)，具体方法参照生产商说明书。为观察血清EVs形态，将Buffer XE洗脱下来的外泌体滴加在载样铜网上，待其干燥后用1%的乙酸双氧铀负染，负染后用透射电子显微镜观察EVs结构。

1.3 mRNA表达谱芯片分析 PD患者及健康个体血清EVs来源的RNA经定量后，采用Affymetrix GeneChip®Human Genome U133 Plus 2.0芯片(Thermo Fisher Scientific)进行mRNA差异表达分析，每个RNA样品上样量为300 ng，具体操作方法参见生产商提供的说明书及早期报道[5]。R软件对PD患者及健康个体血清EVs mRNA表达水平进行差异分析，log2Fold Change(FC)>2或<-2，且P<0.01时，认为差异基因具有统计学意义。

1.4 实时定量PCR反应 实时定量PCR反应(qRT-PCR)用于差异表达基因验证。引物序列经Primer premier 5.0和Oligo 6.0软件设计后，由Invitrogen公司(Thermo Fisher Scientific)合成。M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒(上海生工生物工程公司)用于RNA反转录，产物cDNA作为RT-PCR模板用于基因表达分析。使用MaximaTMSYBR Green qPCR Master Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)试剂，以cDNA为模板，采用ABI 7500实时PCR检测系统(Applied Biosystems)进行实时定量PCR，GAPDH作为内对照，以2-△△CT进行相对定量分析，所有实验独立重复3次，以确定EVs中mRNA相对水平。

2 结 果

2.1 受试者一般资料比较 健康对照个体中，男9例(56.3%)，女7例(43.8%)，平均年龄(58.26±3.23)岁；PD患者中，男10例(45.5%)，女12例(54.5%)，平均年龄(57.51±2.19)岁。两组受试者性别(χ2=0.432，P=0.511)及年龄(t=0.5847，P=0.575)间无统计学差异(P>0.05)，两组间具有可比性。

2.2 PD患者血清EVs中46个mRNA异常表达 EVs洗脱液经负染后，可在透射电子显微镜下观察到直径约30～100 nm的小囊泡，结果证实已从受试者血清中提取到EVs(见图1)。经表达谱芯片分析发现，与健康对照个体(n=6)相比，PD患者(n=6)血清EVs中有46个mRNA表达水平存在显著差异，其中26个mRNA显著上调，20个mRNA显著下调(2

2.3 PD患者血清EVs中8个mRNA持续异常表达 qRT-PCR进一步验证上述差异mRNA在健康对照个体(n=16)和PD患者(n=22)血清EVs中的表达。结果发现，与健康对照个体相比，BCAR3(t=10.58，P=0.0005)、SCEL(t=7.517，P=0.0017)、KLHK12(t=3.988，P=0.0163)、GIPR(t=9.601，P=0.0007)、DZANK1(t=5.008，P=0.0074)在PD患者血清EVs中持续上调；而LIFR(t=4.514，P=0.0107)、ANKRD53(t=11.89，P=0.0003)和TMEM100(t=8.561，P=0.0010)在PD患者血清EVs中持续下调(见图3A、B)。

2.4 BCAR3、SCEL及LIFR特异性存在于PD患者血清EVs中 为明确持续差异表达的8个mRNA是否特异存在于PD患者血清EVs中，qRT-PCR分别检测了这些mRNA在PD患者血清EVs和去EVs血清中的相对水平。结果发现，与去EVs的血清相比，BCAR3和SCEL在PD患者血清EVs中表达水平显著上调(t=3.614，P=0.0225；t=4.595,P=0.0101)，LIFR在PD患者血清EVs中表达水平显著下调(t=24.34，P<0.0001)(见图4)。ANKRD53、TMEM100、GIRP、DZANK1及KLHL12在PD患者血清EVs和去EVs的血清间表达水平无统计学差异(P>0.05)。以上结果证实，BCAR3、SCEL及LIFR特异性存在于PD患者血清EVs中。

表1 PD患者血清EVs中显著差异表达的前20个基因

基因名变化倍数(log2FC)平均表达量t值P值DNAJC1PLAG1F10112ITM2CSDCCAG3GEMIN6LIFRANKRD53CADPSBCAR3TMEM100SCELLIN28ATAF7LKLHL12GIPRDZANK1NAG18ZNF135-2.0601923582.6293150593.130124828-2.026310693-2.2186852652.448153441-2.5354686642.121684895-2.2376487792.583387417-2.291713332.085607137-2.024172141-2.0037439472.2145528842.2811482122.3717337032.1880041642.0953708325.0851773.0699282.6108355.0974374.6403064.1965573.1601443.8547644.5678183.6105753.4621092.8638324.3621084.3032115.3507085.2638763.8532283.0692441.897475-9.086648.2640596.147836-5.90764-5.292725.175882-5.075074.759949-4.738454.68193-4.653554.535008-4.30904-4.287284.2441354.1740124.1245424.0281073.8648326.48E-071.84E-063.88E-055.69E-050.0001580.0001920.0002290.0003970.0004130.0004560.000480.0005940.0008940.0009310.0010070.0011460.0012550.00150.002034

图1 典型的血清EVs电镜图

图2 健康个体及PD患者血清EVs中差异基因热图

图3 qRT-PCR验证健康个体及PD患者血清EVs中差异mRNA的表达*P<0.05

图4 持续差异mRNA在PD患者血清EVs及去EVs血清中的表达*P<0.05

3 讨 论

本研究采用表达谱芯片对比分析了PD患者和健康个体血清EVs中差异表达的mRNA，实时定量PCR对差异表达基因进行验证。结果发现，BCAR3、SCEL、KLHK12、GIPR、DZANK1在PD患者血清EVs中表达水平持续上调，LIFR、ANKRD53和TMEM 100表达水平持续下调。其中，BCAR3、SCEL及LIFR在PD患者血清EVs和去EVs的血清中存在显著差异。本研究结果首次证实，BCAR3、SCEL及LIFR在PD患者血清EVs中表达水平异常改变，且特异存在于PD患者的EVs中。

随着精准医学的快速发展，探索与PD发生发展相关的分子靶标可以增强我们对疾病的认识[6]。近年来，研究发现血清EVs可以递送大量的生物活性物质到受体细胞，参与多种疾病的发生发展。这些生物活性物质包括miRNA、lncRNA、mRNA、DNA、蛋白质及脂质等，其中以miRNA含量最多，研究最为广泛[7]。越来越多的与PD发生发展相关的EVs内容物逐渐被发现[8]。例如，PD患者尿液EVs中Ser(P)-1292 LRRK2水平升高，并与患者的意识障碍程度和自理能力密切相关[9]。Cao等人研究发现PD患者血清EVs中miR-19b表达水平下调，miR-195和miR-24表达水平上调，它们在血清中的表达水平可能有助于PD诊断[10]。此外，研究还发现PD患者脑脊液EVs中含有高水平的α-突触核蛋白，被受体细胞吸收后可引起细胞毒性[11,12]。然而，有关PD患者血清EVs中mRNA差异表达的研究则十分有限。本研究首次通过表达谱芯片分析了PD患者血清EVs中差异表达的mRNA，经PCR验证后发现，BCAR3、SCEL、KLHK12、GIPR、DZANK1在PD患者血清EVs中表达水平上调，LIFR、ANKRD53和TMEM 100表达水平下调。

体液EVs RNA已经成为多种疾病诊断及预后研究的热点，特别是血清EVs中的RNA因其具有较好的稳定性且取材方便，已具备较好的临床应用前景[13]。然而，以往报道的血清标志物主要以游离于血清中的分子为主，本研究则重点关注了PD和正常对照个体血清EVs中差异表达的mRNA。为了进一步证实这些差异表达的mRNA是否特异地存在于血清EVs中，我们分别检测了这些差异基因在PD患者血清EVs以及去除EVs后血清中的表达。结果发现，乳腺癌抗雌激素药物耐药性基因3(Breast cancer anti-estrogen resistance gene 3，BCAR3)和Sciellin蛋白(SCEL)在PD患者血清EVs中的表达水平显著高于去除EVs的血清，而白血病抑制因子受体(LIF receptor alpha，LIFR)在PD患者血清EVs中的表达水平则显著低于去EVs的血清。由此证实，BCAR3、SCEL及LIFR是特异性地存在于PD患者血清EVs中的差异表达基因。

由于PD的发生发展与大脑神经元损伤密切相关[14]，而血清EVs又非常容易穿过血脑屏障将分子特异性地递送到中枢神经系统[15]，因此EVs中异常表达的分子很可能通过不同的信号转导途径参与PD进展。然而，目前有关BCAR3、SCEL及LIFR在PD发生发展中作用机制的研究十分有限。LIFR主要参与细胞分化、增殖和存活，其信号转导途径在神经系统发育中起关键作用，并在PD患者海马和扣带回部位表达水平显著上调[16]，但其影响PD进展的可能机制尚未报道。本研究发现，LIFR表达水平在PD患者血清EVs中显著下调，但其功能仍有待于进一步研究。BCAR3可导致乳腺癌细胞雌激素非依赖性增殖，与乳腺癌发生发展密切相关[17,18]。同样，有研究发现SCEL低表达与结直肠癌的迁移及侵袭能力增强有关[19]。然而，BCAR3和SCEL与PD发生发展间的关系目前尚未被报道。

总之，本研究首次发现BCAR3、SCEL、KLHK12、GIPR、DZANK1在PD患者血清EVs中表达水平上调，LIFR、ANKRD53和TMEM 100表达水平下调。其中，BCAR3、SCEL及LIFR是特异存在于PD患者血清EVs中的差异表达基因。本研究也存在一定的局限性，例如缺少机制研究，尚不能进一步明确上述差异表达的mRNA在PD发生发展中的具体作用，今后仍需在临床水平、动物水平及细胞分子水平进一步探讨其可能的机制。然而，目前的结果可以明确血清EVs中BCAR3、SCEL及LIFR在PD患者中异常表达，可能与PD发生发展密切相关，本研究结果将为EVs相关PD早期诊断以及神经保护研究提供了初步的理论依据。