蛋白质组学技术及其在中医药治疗骨质疏松症研究的应用进展

白璧辉， 谢兴文， 李鼎鹏， 黄晋， 徐世红

（1.甘肃中医药大学，甘肃兰州 730000；2.甘肃省中医药研究院，甘肃兰州 730050；3.甘肃省中医院，甘肃兰州 730050）

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是以骨的含量减少、骨的微观结构出现退化表现，致使增加了骨的脆性，导致易于发生骨折的一种全身性代谢疾病[1]。OP好发于中老年人。近年来，有关OP的防治更加规范细致，中西药物治疗能够显著增加患者的骨密度及骨强度，但不能使OP患者的骨重塑过程恢复平衡。新研发的促进骨合成的药物在刺激新骨形成的同时也刺激了骨吸收，导致其疗效并不稳定。而针对激素水平进行治疗的药物由于靶向性不强，难以进行根本性治疗，且某些药物的不良反应较多，甚至会出现安全性问题。目前OP治疗存在的不足，凸显开展OP早诊断、早预防的意义。利用蛋白质组学易感蛋白的定量技术，可以揭示OP每一阶段的发生、发展的机理，特别是血清蛋白的表达改变，对于早诊断和早预防OP病变过程，具有重要的意义。中医也逐渐将蛋白质组学技术应用于OP的探究中，以探索中医OP证候分型与蛋白质的相关性以及中医药治疗OP的蛋白质水平作用途径。以下通过概述蛋白质组学在中医药治疗OP的应用现状，以期为中医药防治OP提供理论基础。

1 蛋白质组学概述

蛋白质是生物生理功能的全面表达者，其结构和功能的研究能够帮助研究者发现生命体在病理状态下的发展规律并阐述其病变机理。对于研究OP者，蛋白质组学技术为一种非常有针对性的研究目标细胞和组织的工具[2]。目前生命科学的重点也已经转移到了蛋白质的研究上。蛋白质能够比基因更全面地反映生命体的功能及各种作用机制，而且蛋白质是细胞代谢最主要的执行者，同时也作为靶分子作用于多种致病因子。蛋白质组学技术可以直接分析生物样本如血清、尿液、脑脊液等，能够客观准确地反映血清中绝大多数蛋白的含量[3]。随着分子技术的蓬勃兴起，蛋白质组学技术为寻找疾病的生物标志物提供了方向[4]。蛋白质组学可表达更全面的疾病信息，更加接近生命体本质的生理和病理状态。通过蛋白质组学比较不同状况下细胞或组织中蛋白质的数量及位置的差异，寻找疾病的特异蛋白质，可为疾病的发生机制与诊断提供不同的标识，为新药研发提供指导。因而，蛋白质组学的研究有着广泛的临床及应用前景。

2 蛋白质组学常用技术

2.1蛋白质分离技术蛋白质的分离技术是蛋白质组学研究的重要部分，主要包括双向凝胶电泳技术（2-DE）、双向荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）技术、高效液相色谱技术（HPLC）、双向HPLC（2D-HPLC）技术、亲和层析、毛细管电泳等6种分离技术，可用来分析从细胞、体液或组织中提取的复杂的蛋白质混合物。根据蛋白质的特性，可分离数千种不同的蛋白质组成的复杂混合物，并可确定每种蛋白质的相对含量。经过分离蛋白质样品后，可得到分子的等电点及含量两方面的信息。

2.2蛋白质鉴定技术现在普遍应用的蛋白质鉴定技术为生物质谱分析技术，主要包括早期的基质辅助激光解吸离子化质谱（MALDI-MS）、电喷雾离子化质谱（ESI-MS）、表面增强激光解吸离子化质谱（SELDI-MS），以及后期改良的表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术、同位素标记术和标签技术（ICAT）、蛋白质芯片（protein chips）等。由于该类技术具有迅速、灵敏、准确以及高通量、自动化等优点，并能进行蛋白质序列分析和翻译后修饰的分析（糖基化、磷酰化），现已成为蛋白质组学研究中分析与鉴定肽和蛋白的最重要的手段。

2.3生物信息学目前生物信息学已经成为蛋白质组学研究中重要构成部分，研究人员已经为此建立了多个用于蛋白质组学研究的数据库，最常用的3种为SWISS-PROT、EMBL和GEO，其中SWISS-PROT是最大、种类最多的蛋白质组数据库。研究者通过在蛋白质组学数据库中寻找与对比，可更全面地获取蛋白质的结构与功能，从而更系统高效地进行分析，起到对比鉴定的作用。

3 蛋白质组学技术在中医药治疗OP中的应用

3.1单味中药大量研究表明单味中药对OP的治疗具有良好的效果。用于治疗OP的中药主要包括杜仲、熟地黄、淫羊藿、仙茅、骨碎补等。目前已提取多种中药的有效成分用于治疗，但对于其机理的探讨仍较为匮乏。对于单味中药治疗OP作用机理的蛋白质组学研究，曾建春等[5]分析了杜仲诱导MSCs向成骨细胞分化的调控机制，通过电泳分离得到641个蛋白点，并选取了其中的75个进行质谱分析，证明杜仲可通过6个功能蛋白调节成骨细胞的增殖与分化，从而达到治疗OP的效果；薛黎明[6]运用蛋白质组学研究淫羊藿、仙茅单味药防治OP的作用机理，结果显示，淫羊藿中的总黄酮、仙茅中的苯甲酸酯类总酚苷能明显改善OP导致的尿液和血液代谢产物的变化，并参与能量、氨基酸和脂肪的代谢以及氧化应激、细胞骨架形成，同时发现淫羊藿苷和仙茅苷及其配伍可改善成骨细胞和破骨细胞的线粒体膜电势和三磷酸腺苷（ATP）含量。骨碎补主要通过调控骨代谢相关分子及骨形成蛋白通路上相应的靶点，发挥抑制骨吸收及促进骨形成的作用，最终达到治疗OP的目的[7]。

3.2中药复方治疗OP的中药复方主要包括左归丸、六味地黄丸、独活寄生汤、二仙汤等经典名方。相关的临床实验研究报道此类复方可通过促进骨骼矿化，维持骨代谢平衡，达到减轻临床症状，提高治疗效果的目的。卢严方等[8]运用蛋白质组学技术对美国国家生物信息中心（NCBI）中的GEO数据库中六味地黄丸治疗绝经期肾阴虚OP的相关信息进行检索，发现六味地黄丸在治疗肾阴虚型OP绝经期患者时，其基因TNP1和MAP3K10的表达明显增加，而ZNF家族基因和XRN1、XPO1、NUP54等基因的表达显著下降；故认为该复方通过促进雌激素表达及与其受体结合，保持免疫应答平衡而促进骨组织形成，从而达到改善骨代谢作用。而陈娟等[9]采用传统的免疫组化研究，发现六味地黄丸治疗肾阴虚型OP绝经期患者是通过调控JAK/STAT通路中IRF1基因信号干预免疫功能而实现的。以上文献分析表明蛋白质组学技术比免疫组化方法的研究结果更加全面，并有助于进一步的探析。

对于二仙汤、左归丸、壮骨止痛方作用机制的研究，刘志文等[10]研究二仙汤对去卵巢骨质疏松大鼠股骨蛋白质组的影响，检测股骨组织蛋白，通过定量分析差异表达蛋白的强度，共发现41种差异表达蛋白（主要包括生物氧化相关蛋白、信号转导途径相关蛋白等），发现差异表达的蛋白质如碳酸酐酶2和整合素β1是二仙汤的作用靶点。张颖等[11]对去卵巢OP大鼠的双侧股骨骨髓进行蛋白质双向电泳并对其电泳图谱进行分析，筛选出与左归丸疗效的相关蛋白，并进行质谱分析，共筛选出23个差异蛋白点，鉴定出其中的11个蛋白质点，包括果糖酸缩酶A、抗氧化蛋白6、α烯醇化酶、烯醇化酶3、白蛋白、钙网蛋白、蛋白二硫化物异构酶A3等；发现左归丸通过调节含以上相关蛋白的细胞的增殖、分化、代谢、凋亡等来治疗OP。杨军等[12-13]对去卵巢大鼠OP模型股骨的蛋白质进行双向电泳，获得各组总蛋白质的图谱，用图像分析各组间差异蛋白质点并结合蛋白质生物信息库（MLD），对各蛋白质进行鉴定，发现X1（胰岛素受体蛋白）、X2（热休克同源蛋白）、X3（分泌颗粒素Ⅱ）这3种差异蛋白在壮骨止痛方治疗OP的过程中发挥着重要的调控作用。

3.3针刺治疗针灸作为临床上的常用治疗方法，能够从整体或多脏腑进行靶点性的全面治疗，疗效肯定并具有安全性高、成本低等优点，在治疗OP方面具有一定的优势。现代研究发现针灸治疗OP能够抑制破骨细胞关键调控因子OPG和RANKL mRNA表达，刺激成骨细胞特异基因CB1 mRNA表达，调节骨量平衡，同时通过提高Ⅰ型胶原氨基端延长肽水平及降低β-Ⅰ型胶原羧基端肽来改善临床症状[14-15]。秦玮等[16]采用蛋白质组学技术分析针刺命门穴治疗绝经后OP的机制：以电针刺激去卵巢OP大鼠命门穴，观察去卵巢OP大鼠下丘脑骨形态发生蛋白2（BMP-2）及其信号转导蛋白Smad1/5表达的调节机制。实验结束后，采用免疫组化法检测下丘脑BMP-2及其信号转导蛋白Smad1/5的表达。结果显示实验组下丘脑BMP-2及其信号转导蛋白Smad1/5阳性细胞总面积、阳性细胞平均灰度值与两个模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。以上结果不仅为针刺命门穴治疗绝经后OP提供一定的理论依据，而且为运用蛋白质组学技术研究针刺治疗OP的作用机制提供了思路与方法。

4 讨论

关于OP发病机理，目前认为其机制与骨的抑制、吸收及骨形成之间的失衡有关，研究多集中在基因水平，如OPG/RANKL/RANK系统、Wnt/βcatenin 途径、Cbfa1、Osterix、Runx、Cathepsin K等转录因子及酶的作用机制已经逐渐被揭示，但大多以单基因或小基因、单通路或小通路研究为主，未能从整体蛋白质水平去探索发病规律[17]。蛋白质组学的研究能直接反映1个基因组或者1种细胞/组织中携带的信息及所表达的全部蛋白质。蛋白质是完成生命活动的最终形式，能比基因更加真实全面地反映生物体的功能及各种作用机制[18-19]。中医学相对于现代医学虽然对疾病的微观认识和处置方法有所不同，但中医也逐渐将蛋白质组学方法应用于疾病的研究。采用蛋白质组学技术筛选和鉴定血清中OP状态和正常生理状态下的差异表达蛋白，将有利于OP的发生机理的阐明，为中医药早期诊断与及时治疗OP提供理论基础，并为后期研发针对OP人群的治疗药物提供依据。

目前针对中医药治疗OP的蛋白质组学研究还比较少，且以在体动物和离体细胞实验为主，文献报道数量不多。随着蛋白质组学技术的改进及其在OP防治领域的进一步应用，将会进一步发掘出与OP疾病相关的蛋白质。探究引起OP的蛋白质组成，揭示差异蛋白影响OP发生的机理，并利用蛋白质组学的现代化技术对中医辨证分型进行探究，利用生物信息学资料比较分析实现微观辨证分型，将对促进对OP早期诊断和预防、及时治疗和中医药现代化具有重大意义。