黄连碱对过氧化氢损伤的血管内皮细胞保护作用

韦晟 刘金春 葛卫红

[摘要] 目的 探討黄连碱对过氧化氢（H2O2）损伤的血管内皮细胞的保护作用及其机制。 方法 将体外培养的人脐静脉内皮细胞（EA.hy926）分为对照组、模型组、给药组。对照组加入新鲜培养基，模型组给H2O2刺激4 h，给药组用不同浓度的黄连碱（2.5、5、10、20、40 μmol/L）预处理4 h，再用H2O2刺激4 h。采用MTS法检测细胞活力，荧光探针-二氢乙啶（DHE）染色法检测细胞内活性氧（ROS），Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡，Western blot检测凋亡相关蛋白caspase-3、Bcl-2和Bax的变化。 结果 与对照组比较，模型组细胞存活率和Bcl-2蛋白的表达明显降低，细胞内ROS含量、细胞凋亡率、caspase-3和Bax蛋白的表达明显升高（P < 0.01）;而与模型组比较，给药组细胞的存活率和Bcl-2蛋白的表达均随着给药浓度的增加而逐渐升高，细胞内ROS含量、细胞凋亡率、caspase-3和Bax蛋白的表达均随着给药浓度的增加而逐渐下降，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 黄连碱是通过抑制H2O2诱导的EA.hy926细胞存活率降低、细胞内ROS升高、细胞凋亡增多、caspase-3和Bax蛋白表达的上调以及Bcl-2蛋白表达的下调，发挥其对H2O2损伤的血管内皮细胞的保护作用，且呈剂量依赖性。

[关键词] 黄连碱;EA.hy926细胞;氧化应激;细胞凋亡

[中图分类号] R54          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）01（c）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the protective effect and mechanism of coptisine on vascular endothelial cells induced by hydrogen peroxide （H2O2）. Methods Human umbilical vein endothelial cells （EA.hy926） cultured in vitro were divided into control group， model group and drug administration group. The control group was added with fresh medium， and the model group was stimulated by H2O2 for 4 h. The drug-treated group was pretreated with different concentrations of coptisine （2.5， 5， 10， 20， 40 μmol/L） for 4 h， and then stimulated with H2O2 for 4 h. Cell viability was detected by MTS assay， intracellular reactive oxygen species （ROS） was detected by ROS fluorescent probe - dihydroethidine （DHE） staining， apoptosis was detected by Annexin V-FITC/PI double staining， and Western blot was used to detect the changes of apoptosis-related proteins caspase-3， Bcl-2 and Bax. Results Compared with the control group， the cell viability and Bcl-2 protein levels of the model group were markedly decreased， whereas the ROS levels， apoptotic rate， caspase-3 and Bax protein levels were significantly increased （P < 0.01）. However， compared with the model group， the cell viability and Bcl-2 protein levels of dosing group were increased gradually with the increasing concentration of coptisine， while the ROS levels， apoptotic rate， caspase-3 and Bax protein levels were decreased gradually with the increasing concentration of coptisine （P < 0.01）. Conclusion Coptisine exerts its protective effect on vascular endothelial cells injured by H2O2 in a dose-dependent manner by inhibiting the decrease of survival rate， the increase of ROS， the increase of apoptotic rate， the up-regulation of caspase-3 and Bax protein expression and the down-regulation of Bcl-2 protein expression in EA.hy926 cells induced by H2O2.

[Key words] Coptisine; EA.hy926 cell; Oxidative stress; Apoptosis

心血管疾病是严重危害人类健康的重大疾病[1]。血管内皮功能障碍已成为多种心血管疾病的关键调控因素[2]。氧化应激诱导血管内皮细胞损伤是诱发包括动脉粥样硬化在内的多种心血管疾病的一个重要因素[3-4]。因此，寻找能够对抗活性氧引起的氧化应激和细胞凋亡、可治疗动脉粥样硬化的自由基清除剂具有重要临床意义。黄连碱是一种天然的原小檗碱型生物碱季铵盐，存在于毛茛科和罂粟科的多种植物中[5]。黄连碱通过抗氧化、抑制RhoA/Rho激酶通路、抗心肌细胞凋亡和炎症对心肌梗死的大鼠具有心肌保护作用[6-7]。然而，黄连碱的抗动脉粥样硬化的作用机制至今尚不清楚。本研究拟探讨黄连碱对过氧化氢（H2O2）损伤的血管内皮细胞的保护作用及其机制，为黄连碱防治心血管疾病提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

EA.hy926细胞购自中科院上海细胞生物学研究所;DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶均购自美国Gibco公司;细胞增殖和细胞毒实验检测试剂盒MTS购自美国Promega公司;Annexin V-FITC/PI试剂盒购自美国BD公司;DHE-ROS活性氧检测试剂盒购自北京威格拉斯公司;黄连碱、H2O2购自美国Sigma公司;caspase-3、Bax、Bcl-2、Tubulin、辣根过氧化物酶二抗购自美国Bioworld公司。

1.2 方法

1.2.1 MTS法检测黄连碱对H2O2损伤的EA.hy926细胞存活率的影响  取对数生长期的EA.hy926细胞，按照每孔约5×103个接种于96孔培养板中，100 μL/孔;待其贴壁后，分为对照组、模型组和给药组;对照组加入新鲜培养基，模型组给予250 μmol/L的H2O2刺激4 h，给药组用不同浓度的黄连碱（2.5、5、10、20、40 μmol/L）预处理4 h，其后用H2O2刺激4 h;每孔加入20 μL的MTS溶液，继续孵育4 h后，在酶标仪上于490 nm波长测定各孔光密度值。

1.2.2 荧光探针-二氢乙啶（DHE）染色法检测黄连碱对H2O2损伤的EA.hy926细胞内ROS的影响  取对数生长期的EA.hy926细胞，按照每孔约1×105个细胞接种于12孔板中，每孔1 mL;细胞贴壁后，对照组和模型组处理方法同“1.2.1”，给药组用低、中、高浓度的黄连碱（5、10、20 μmol/L）预处理4 h，再用H2O2刺激4 h;按照DHE-ROS活性氧检测试剂盒上的说明检测细胞中ROS含量。

1.2.3流式细胞术检测黄连碱对H2O2诱导的EA.hy926细胞凋亡的影响  取对数生长期的EA.hy926细胞，按照每孔约2×105个细胞接种于6孔板，每孔1 mL，24 h后细胞贴壁，同上述实验分组和给药处理后，收集细胞，并按照Annexin V-FITC/PI试剂盒上的说明检测细胞凋亡情况。

1.2.4 Western blot检测EA.hy926细胞中凋亡相关蛋白的表达  取对数生长期的EA.hy926细胞，按照每孔约5×105个细胞接种于直径为6 cm的培养皿中，每皿3 mL，24 h后细胞贴壁，同上述实验分组和给药处理后，收集细胞并裂解，于4℃、12 000 g条件下离心15 min，收集上清液。BCA法测定蛋白浓度后，制备12%分离胶、5%浓缩胶进行SDS-PAGE电泳，转膜。5%的BSA封闭2 h后，caspase-3（1∶500）、Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶500）、微管蛋白（Tubulin，1∶5000）于4℃下孵育过夜。用TBST洗膜3次，二抗室温孵育1 h后，再用TBST洗膜3次，接下来电化学发光（ECL）显色，并用Image J软件进行定量分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±標准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 黄连碱对H2O2诱导的EA.hy926细胞存活率的影响

MTS实验结果显示，与对照组比较，模型组的细胞存活率显著降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与模型组比较，2.5 μmol/L给药组细胞存活率没有明显变化，差异无统计学意义（P > 0.05）;5、10、20、40 μmol/L给药组细胞存活率明显升高，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。

2.2 黄连碱对H2O2诱导的EA.hy926细胞内ROS的影响

DHE染色结果显示，与对照组比较，模型组中红色荧光强度显著增强，提示细胞中ROS含量明显升高;与模型组比较，给药组红色荧光强度随着给药浓度的增加逐渐减弱，提示细胞中ROS含量降低。

2.3 黄连碱对H2O2诱导的EA.hy926细胞凋亡的影响

Annexin V-FITC/PI双染结果显示，与对照组比较，模型组中细胞凋亡率明显升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）;与模型组比较，给药组细胞凋亡率随着给药浓度的增加逐渐降低，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。

2.4 Western blot检测EA.hy926细胞中凋亡相关蛋白的表达

Western blot检测结果显示，与对照组比较，模型组细胞内caspase-3和Bax蛋白表达量明显增加，而Bcl-2蛋白表达水平明显降低，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）;与模型组比较，给药组细胞内caspase-3和Bax蛋白的表达均随着给药浓度的增加而逐渐下调，而Bcl-2蛋白表达水平随着给药浓度的增加而逐渐上调，从而降低Bax/Bcl-2的比值，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。

3 讨论

动脉粥样硬化引起的心血管疾病严重危害着人类健康[8]。氧化应激贯穿动脉粥样硬化斑块的形成、发展及斑块破裂触发临床事件的始终，被认为是其致动脉粥样硬化发生、发展的重要机制[9-10]。氧化应激是指机体产生过量的ROS与清除ROS的抗氧化系统之间的失衡，导致体内的ROS增多，并引起细胞氧化损伤的过程[11]。在培养基中添加H2O2引起的氧化损伤过程与体内ROS诱导细胞损伤的病理过程相类似[12]。因此，本研究采用H2O2体外诱导EA.hy926细胞制备氧化应激模型，观察黄连碱对血管内皮细胞的保护作用及其机制。

本研究首先通过MTS法检测不同浓度黄连碱对H2O2损伤的EA.hy926细胞存活率的影响，结果表明，黄连碱能够抑制H2O2导致的EA.hy926细胞氧化损伤，且在5～20 μmol/L呈明显的浓度依赖性。DHE法检测细胞内ROS的结果进一步证实黄连碱具有抑制H2O2诱导的细胞氧化应激的作用。

当血管内皮损伤或暴露于ROS时，会导致内皮细胞发生凋亡[13]。通过Annexin V-FITC配合PI进行双染，并利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，可以用来区分正常细胞、早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞，并反映出细胞凋亡的进程[14]。本研究显示，H2O2处理后细胞凋亡率明显升高，其中尤以晚期凋亡为主，达到49.18%;黄连碱给药组细胞凋亡率显著降低，当给药浓度为20 μmol/L时，细胞凋亡率仅为4.54%，提示黄连碱在一定程度上能抑制H2O2诱导的EA.hy926细胞凋亡的发生，且呈良好的浓度依赖性。细胞的凋亡与抗凋亡间存在一种精细平衡，这种平衡一旦被打破，则可启动细胞的凋亡程序[15]。

细胞凋亡是机体在内外环境刺激下启动的由基因调控的细胞死亡过程，ROS能够激活凋亡启动分子，从而促使细胞凋亡的发生[16]。在细胞凋亡过程中，caspase-3占据核心地位，被称为“死亡执行蛋白酶”[17]。因此，caspase-3的激活常被为作为判断细胞凋亡的可靠指标之一。本研究发现，H2O2能够使细胞内caspase-3蛋白表达量明显增加;黄连碱能显著下调caspase-3蛋白的表达。此外，caspase的活性在凋亡发展过程中也可被细胞内众多的蛋白质调节，如Bcl-2家族蛋白分子[18]。Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡中发挥着重要的调控作用，其中Bax/Bcl-2的比例决定了细胞对诱导凋亡信号的敏感性[19-20]。本研究结果显示，黄连碱呈浓度依赖性地抑制H2O2诱导的EA.hy926细胞中Bax表达上调、Bcl-2的表达下调，从而显著降低Bax/Bcl-2的比值，最终抑制H2O2诱导的EA.hy926细胞凋亡。

综上所述，本研究采用H2O2诱导的EA.hy926内皮细胞氧化损伤模型考察黄连碱的抗氧化损伤作用。结果表明，黄连碱通过抑制H2O2诱导的EA.hy926细胞存活率降低、细胞内ROS升高、细胞凋亡增多、caspase-3和Bax蛋白的表达上调以及Bcl-2蛋白表达的下调，从而发挥其对H2O2损伤的血管内皮细胞的保护作用。因缺乏体内实验的验证，本研究的结果具有一定的局限性，但本研究为黄连碱的进一步开发提供了一定的理论基础。

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（收稿日期：2018-05-14  本文编辑：王   蕾）