IL-6、CAT、MPO在大鼠肝脏缺血再灌注损伤中的作用

章小兵 翟淑萍 苑伟 颜勇 张北平 王百林

[摘要] 目的 探讨白细胞介素-6（IL-6）、过氧化氢酶（CAT）、髓过氧化物酶（MPO）与大鼠肝脏缺血再灌注损伤（HIRI）关系及其损伤机制。 方法 选取6周龄SD大鼠150只，采用肝門部血流阻断法制备大鼠HIRI模型。采用简单随机分组原则将大鼠分为HIRI组（n = 75）、缺血再灌注对照（Control）组（n = 75）;每组再分成3个亚组，分别为缺血再灌注后1 h组、3 h组、6 h组，每亚组各25只;分别在缺血再灌注后1、3、6 h抽取两组大鼠下腔静脉血液，检测血清中IL-6水平;切取适量肝组织，检测肝组织内的CAT、MPO活性，并用以评估两组各时间点HIRI情况。 结果 与Control组同期比较，HIRI组在肝脏缺血再灌注后1、3、6 h的IL-6含量、MPO活性高于Control组，但CAT活性较Control组降低（均P < 0.05）。 结论 大鼠HIRI与急性炎性细胞因子IL-6及MPO释放增多以及与CAT释放抑制而导致氧自由基清除障碍有关。

[关键词] 肝缺血再灌注;过氧化氢酶;白细胞介素-6;髓过氧化物酶

[中图分类号] R657.3          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）01（c）-0008-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between interleukin-6 （IL-6）， catalase （CAT）， myeloperoxidase （MPO） and hepatic ischemia-reperfusion injury （HIRI） in rats and its mechanism. Methods A total of 150 SD rats aged 6 weeks were selected and the HIRI model was established by blocking hepatic portal blood flow. Rats were divided into HIRI group （n = 75） and liver ischemia-reperfusion （Control） group （n = 75）. Each group was divided into three subgroups： 1 h group， 3 h group and 6 h group after ischemia-reperfusion， with 25 rats in each subgroup. The inferior vena cava blood of the two groups were extracted at 1， 3 and 6 h after ischemia-reperfusion to detect the level of IL-6 in serum. The appropriate amount of liver tissue was cut， the activities of CAT and MPO in liver tissue were measured， and the situations of HIRI were evaluated at each time point in the two groups. Results Compared with the Control group， IL-6 and MPO activities in the HIRI group were higher than those in the Control group at 1， 3， and 6 h after hepatic ischemia-reperfusion， but the CAT activity was lower than that in the Control group （all P < 0.05）. Conclusion The HIRI in rats is associated with the increase of IL-6 and MPO as well as with oxygen free radical scavenging disturbance caused by inhibition of CAT release.

[Key words] Hepatic ischemia-reperfusion; Catalase; Interleukin-6; Myeloperoxidase

肝脏缺血再灌注损伤（hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI）是发生在肝切除或者肝脏移植术后的一种病理生理反应，明显影响到肝功能及预后。肝血流阻断法是肝脏外科中常用的手术技巧，可用于控制术中大出血，降低输血率。虽然肝血流阻断技术能有效地控制术中出血，但同时也不可避免地带来了HIRI损伤的副作用。HIRI损伤能够诱导氧自由基的激活，从而导致氧化应激反应和细胞死亡，最终引起无菌性炎性反应，使肝细胞损伤和肝功能受损，严重的还会导致急性肝功能衰竭。目前，临床上仍缺乏预防和治疗HIRI的有效办法，且其具体机制尚待进一步深入研究[1-4]。肝脏缺血后早期发生的快速氧化还原反应是已知的损伤机制之一，这一过程主要由肝细胞、库普弗细胞、肝窦内皮细胞介导，晚期还和肝组织中淋巴细胞浸润、细胞因子的产生有关[5-6]。因此，研究HIRI的机制具有一定的临床意义。本研究通过建立HIRI大鼠模型，检测大鼠血清中白细胞介素-6（IL-6）含量及肝组织匀浆中过氧化氢酶（CAT）、髓过氧化物酶（MPO）的活性，探讨HIRI机制，为预防其损伤提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验动物  选取6周龄SD大鼠150只，体重250～300 g，均购自广州中医药大学实验动物中心，雌雄不限，动物合格证编号：SCXK（粤）2013-0020，饲养于SPF级实验室，实验室温度为22～24℃，湿度40%～60%，自由进食、进水，适应新环境1周。

1.1.2 实验试剂  IL-6 ELISA试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司（生产批号：CSB-E04640r）;过氧化氢酶测试盒和髓过氧化物酶测试盒均购自南京建成生物工程研究所（生产批号：A044、A007-1）。

1.1.3仪器  Scanspeed 1730R低温离心机（丹麦LaboGene公司）;DNP-9162电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）;DK-8D电热恒温水槽（上海一恒科学仪器有限公司）;752型紫外-可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）;iMark酶标仪（美国BIO-RAD）。

1.2 方法

1.2.1 分组  按简单随机分组原则将150只SD大鼠分为HIRI组（n = 75）、缺血再灌注对照（Control）组（n = 75）;每组再分成3个亚组，分别是缺血再灌注后1 h组、3 h组、6 h组，每亚组各25只。

1.2.2 建立模型与取材  造模12 h前开始禁食、3 h前开始禁水，对每只实验大鼠进行称重、编号。配制1%水合氯醛，按1 mL/100 g对大鼠进行腹腔内注射麻醉。麻醉后，参照余淑珍等[7]改良SD大鼠急性HIRI制备方法制备动物模型。具体操作：HIRI组以无损伤血管夹阻断肝门30 min，其后松开血管夹，恢复血流，模拟大鼠肝脏缺血后再灌注。Control组大鼠仅切开腹壁，显露肝门，不进行肝门阻断，其他手术过程同HIRI组。4-0细丝线逐层关腹，电热毯加热复温。分别于术后1、3、6 h对各亚组大鼠进行取材，各亚组每只大鼠每次抽取下腔静脉血1 mL;切取适量肝组织制备匀浆液，3000 r/min离心20 min，收集上清液，置入-80℃冰箱中保存待测。

1.3 检测指标

分别用IL-6试剂盒、CAT试剂盒、MPO试剂盒检测血清IL-6表达水平和肝组织中的CAT和MPO活性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

HIRI组大鼠肝脏缺血再灌注后不同时间点的血清中IL-6含量、肝组织匀浆液中MPO活性明显高于Control组同期，差异均有统计学意义（P < 0.05）。HIRI组大鼠肝脏缺血再灌注后不同时间点的肝组织匀浆液中CAT活性明显低于Control组同期，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

3 讨论

肝切除术和肝移植术在临床上已被广泛采用来治疗肝脏疾病。术中为控制出血，各种肝血流阻断方法应运而生。自1908年澳大利亚外科医生Pringle第一次通过压迫肝十二指肠韧带阻断门静脉和肝动脉血流为一位因外伤致肝挫裂伤的患者手术止血[8-9]至今，肝脏外科已获得长足进步。然而，HIRI仍然是制约肝脏外科发展的主要问题之一，HIRI不只是发生于肝脏本身的病理生理过程，还是一个影响多种组织和器官功能的全身性、复杂性反应。其能够严重影响肝功能，甚至产生不可逆转的损伤，引起多器官瀑布式功能障碍。其病理生理过程复杂，机制尚未清晰。已知的机制包括钙超载线粒体通透转换孔道、氧化应激、HIRI相关炎性细胞因子、核转录因子、热休克蛋白、一氧化氮等。目前，其研究主要集中在多种炎性因子释放、氧自由基损伤、中性粒细胞黏附和过度活化及肝脏微循环障碍等学说[10-11]。

HIRI涉及肝脏炎性反应，如多种炎性细胞因子如IL-6、MPO和氧自由基清除障碍等[12]。HIRI氧自由基生成增多和清除障碍有关[13-14]。

IL-6是属于白细胞介素，它是由IL-6基因编码、由T细胞和巨噬细胞分泌的促炎细胞因子，同时也是抗炎肌动蛋白。其在炎症、创伤、恶性肿瘤等多种急慢性炎性反应中表达增多[15-16]。肝脏发生缺血再灌注时，组织内的氧自由基可通过多种机制导致IL-6爆发性水平升高。此外，Faitot等[16]研究发现，IL-6能够反映细胞溶解，有助于预测肝移植术术后早期血管相关性并发症，也是预测肝移植术后远期生存率的可靠生物标志物。

MPO与体内中性粒细胞的功能和激活有关，MPO的含量和活性大小反映了嗜中性多形核白细胞（PMN）的功能和活性程度[17-18]。本研究中HIRI组缺血再灌注后1、3、6 h大鼠血清中IL-6含量和肝组织匀浆液中MPO活性显著高于Control组同期（P < 0.05），提示大鼠HIRI的发生可能与多种炎性细胞因子释放、中性粒细胞黏附和过度活化相关。

氧自由基的生成是HIRI中重要的原因之一，有效清除氧自由基可明顯减轻HIRI[19]。CAT是生物防御体系的关键酶之一，可使得过氧化氢（H2O2）分解为氧和水，阻止羟自由基的生成，减少H2O2对细胞毒害[20]。CAT在肝脏中浓度较高。本研究中，与Control组比较，HIRI组在缺血再灌注后1、3、6 h大鼠肝组织匀浆液中CAT活性明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05），提示HIRI发生后，机体对氧自由基清除可能发生障碍。

综上所述，HIRI发生机制与HIRI后IL-6过表达和CAT及MPO含量变化有关。因此，抑制炎性细胞因子的过度表达、加速体内氧自由基的清除，可能是保护肝切除或肝移植术后肝脏功能的重要治疗性策略。

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（收稿日期：2018-05-22  本文编辑：王   蕾）