长期服用奥氮平对大鼠糖原代谢及糖转运蛋白表达的影响

董文凤 杜向东

[摘要] 目的 研究長期服用奥氮平对大鼠糖原代谢及糖转运蛋白表达的影响，探讨奥氮平影响糖代谢的可能机制。 方法 将12只健康雄性SPF级SD大鼠按照随机数字表法分为对照组（n = 6）和药物组（n = 6），药物组大鼠每天以奥氮平混悬液2.1 mg/kg体重灌胃，对照组大鼠每天以等体积蒸馏水灌胃，持续63 d。定期监测大鼠的摄食量、体重变化、空腹血糖（FBG）和空腹胰岛素（FINS），计算胰岛素敏感指数（ISI）和胰岛素抵抗稳态评价模型指数（HOMA-IR）。给药63 d后采集两组大鼠的肝脏、肌肉和脂肪组织，检测肝脏和肌肉组织中糖原含量和糖原合酶（GS）活性，Western blot法检测肝脏和肌肉组织中GS以及肝脏、肌肉和脂肪组织中葡萄糖转运体（GLUT）的蛋白表达，PCR法检测肝脏、肌肉和脂肪组织中GLUT的mRNA表达。 结果 与对照组比较，长期给予奥氮平后药物组大鼠摄食量和体重增加，FBG和FINS升高，糖原含量减少，GS活性提高但蛋白表达不变;GLUT蛋白表达和mRNA表达均降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 在奥氮平长期诱导下，机体糖原分解增加，糖转运能力下降，产生胰岛素抵抗，这可能是长期服用奥氮平后糖代谢异常的机制之一。

[关键词] 奥氮平;血糖;糖原;葡萄糖转运体

[中图分类号] R749.3          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）01（c）-0011-05

[Abstract] Objective To study the effects of subchronic Olanzapine treatment on the metabolism of glycogen and expression of glucose transporter in rats and to investigate the possible mechanism of Olanzapine′s effects on glycometabolism. Methods Twelve healthy male SPF grade Sprague-Dawley （SD） rats were divided into control group （n = 6） and drug group （n = 6） according to random number table method. Rats in drug group were given 2.1 mg/kg Olanzapine suspension per day according to body weight by gavage and rats in control group were given the same volume of distilled water by gavage for 63 days. The food intake， change of body weight， levels of fasting blood glucose （FBG） and fasting insulin （FINS） were detected periodically. The insulin sensitivity index （ISI） and homeostasis model assessment of insulin resistance （HOMA-IR） were calculated. After 63 days， the liver， muscle and adipose tissues were collected and the content of glycogen and activity of glycogensynthase （GS） in liver and muscle tissues were detected. Western blot was used to assay the protein expression of GS in liver and muscle tissues and glucose transporter （GLUT） in liver， muscle and adipose tissues. PCR was used to assay the mRNA expression of GLUT in liver， muscle and adipose tissues. Results Compared to rats of control group， the subchronic Olanzapine treatment led to an increase of food intake， body weight， FBG and FINS in drug group， while the content of glycogen was reduced， the activity of GS was increased but the protein expression of GS was unchanged; the protein and mRNA expression of GLUT in liver， muscle and adipose tissues were decreased with highly statistically significant differences （P < 0.01）. Conclusion Subchronic Olanzapine treatment can increase glycogenolysis， decrease the capacity of glucose transport and result in generating insulin resistance， which may be one of the mechanisms lead to abnormal glucose metabolism after subchronic administration of Olanzapine.

[Key words] Olanzapine; Blood glucose; Glycogen; Glucose transporter

精神分裂症是精神科最常见的一种高致残、高复发、慢性、难治性疾病，抗精神病药物是主要的治疗手段。因作用谱广、安全性高，第二代抗精神病药物在精神分裂症治疗中处方量很大。但随着第二代抗精神病药物的广泛应用，该类药物被发现会引起体重增加、血糖异常等代谢相关不良反应[1-3]，这不但会诱发心脑血管疾病，而且降低了患者的生活质量和治疗满意度，影响患者的用药依从性和疾病的转归[4-5]。

在第二代抗精神病药物中，奥氮平处方量较大，引起代谢异常的报道相对较多[6-8]。该药物诱发糖代谢紊乱的风险已被证实，药品说明书也明确标示“接受奥氮平治疗的患者，应定期检查血糖控制情况”。但奥氮平引起糖代谢异常的机制至今不明。本研究建立长期给予奥氮平的大鼠模型，观察奥氮平对糖原代谢及糖转运蛋白表达的影响，探讨奥氮平药源性高血糖的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康雄性SPF级SD大鼠12只，体重180～220 g，6～8周龄，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，适应性饲养1周后，按照随机数字表法分为药物组（n = 6）和对照组（n = 6）。每天17∶00，药物组以奥氮平混悬液（商品名：欧兰宁，江苏豪森药业股份有限公司，碾粉后用蒸馏水溶解制成混悬液）2.1 mg/kg体重灌胃，空白组以等体积蒸馏水灌胃，持续63 d。实验期间，自由进食普通饲料，自由饮水。

1.2 摄食量、体重和空腹血糖（FBG）的测定

每天记录大鼠的摄食量，每周称1次体重。每周在固定时间禁食12 h后，经尾静脉采血10 μL，按照罗氏血糖仪（卓越型）的操作说明测定FBG值。

1.3 空腹胰岛素（FINS）水平的测定以及胰岛素敏感指数（ISI）和胰岛素抵抗稳态评价模型指數（HOMA-IR）的计算

每周在固定时间禁食12 h后，经尾静脉采血100 μL，静置30 min，离心，取血清，酶联免疫吸附测定（ELISA）法测定FINS值：标准品孔每孔加不同浓度的标准品50 μL;样品孔每孔加40 μL样品稀释液和10 μL待测样品，混匀;加检测抗体100 μL，37℃温育1 h;洗涤5次，拍干;加显色剂100 μL，混匀，37℃避光显色15 min;加50 μL终止液，15 min内用酶标仪在450 nm处测定吸光度（OD值）;以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线计算样品浓度（即FINS值），并按公式ISI=ln[1/（FBG×FINS）]和HOMA-IR=FBG×FINS/22.5分别计算长期给予奥氮平后机体的ISI和HOMA-IR值。

1.4 采集标本

给药结束后处死大鼠，分别采集肝脏、脂肪、肌肉组织，称重，4℃保存待测。

1.5 肝糖原和肌糖原含量的测定

取待测肝脏、肌肉组织，按样本重量（mg）∶碱液体积（μL）=1∶3加入试管，沸水浴20 min，冷却得糖原水解液，用双蒸水将糖原水解液制成1%肝糖原检测液（5%肌糖原检测液），按照试剂盒说明书测定糖原含量。

1.6 糖原合酶（GS）活性及蛋白表达水平的检测

取待测肝脏、肌肉组织，按1∶10加入提取液，冰浴下匀浆，4℃、8000 g离心10 min，取上清，用紫外分光光度计在340 nm处测定吸光度，按照试剂盒说明书计算GS活性。

Western blot法测定GS的蛋白表达：取待测肝脏、肌肉组织，以GAPDH为对照，SDS-PAGE电泳后转膜，以1%牛血清白蛋白（BSA）对膜进行封闭;加一抗与对照抗体，4℃孵育过夜;洗涤后加二抗，37℃孵育1 h;洗涤后荧光成像，以目的蛋白与内参蛋白的比值计算GS的蛋白表达量。

1.7 葡萄糖转运蛋白（GLUT）表达能力的检测

Western blot法测定GLUT的蛋白表达：取待测肝脏、肌肉和脂肪组织，以GAPDH为对照，具体方法同“1.6”。

PCR法测定GLUT的mRNA表达：取待测肝脏、肌肉和脂肪组织，以β-actin为对照，提取总RNA，反转录成cDNA，用荧光定量PCR仪检测目的蛋白的mRNA表达水平。以2-△△Ct法计算mRNA相对表达量。PCR反应体系：4 μL dNTP Mix、2 μL Primer Mix、5 μL RNA模板、4 μL 5×SuperRT Buffer、1 μL SuperRT、4 μL灭菌蒸馏水。扩增条件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，40个循环。引物序列如下，GLUT2上游引物：5′-TTCCGGAAGAAGAGTGGTTCG-3′，下游引物：5′-TGGTCGGTTCAACTCCACACCG-3′;GLUT4上游引物：5′-CATTGTCTCCTGCATCTCGTC-3′，下游引物：5′-ATTCCGCAATCTAGGCTCGTC-3′;β-actin上游引物：5′-ATGGAATCCTGTGGCATCCAT-3′，下游引物：5′-TCCTGCATCCTGTGAGCAATG-3′。

1.8 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对摄食量、体重的影响

实验第35天后，药物组摄食量大于对照组。实验第14天后，药物组体重普遍大于对照组，但该阶段内的差异无统计学意义（P > 0.05）;实验结束时，药物组体重明显大于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.2 对FBG的影响

实验前7 d，两组大鼠FBG均有一过性升高;之后两组FBG均下降;至35 d时，两组FBG趋于相等，基本稳定在给药前的水平;35 d后，药物组FBG整体高于对照组;第56天时，两组比较差异有统计学意义（P < 0.05）;第63天时，两组比较差异有高度统计学意义（P < 0.01）。

2.3 对FINS、ISI和HOMA-IR的影响

实验前14 d，两组大鼠FINS均持续升高;14 d后，两组FINS均下降;35 d后，对照组FINS基本稳定在同一水平上，而药物组FINS整体升高;第63天时，药物组FINS高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。计算ISI和HOMA-IR发现，第63天，药物组ISI（-6.00±0.09）较对照组（-5.71±0.10）下降，差异有统计学意义（P < 0.05）;药物组HOMA-IR（17.95±1.57）大于对照组（13.46±1.32），差异有高度统计学意义（P < 0.01）。

2.4 对糖原含量的影响

测定喂养结束后大鼠肝脏和肌肉组织中糖原含量发现，药物组肝糖原含量[（5.95±0.17）mg/g]较对照组[（6.37±0.45）mg/g]减少，差异有统计学意义（P < 0.05）;药物组肌糖原含量[（1.25±0.06）mg/g]与对照组[（1.35±0.05）mg/g]比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.5 对GS的活性及蛋白表达的影响

检测喂养结束后大鼠肝脏和肌肉组织中的GS发现，药物组肝脏GS活性[（1774.00±880.47）nmol/（min·g）]较对照组[（458.17±224.47）nmol/（min·g）]增加，差异有统计学意义（P < 0.05）;药物组肌肉GS活性[（1486.83±2255.08）nmol/（min·g）]与对照组[（678.47±1426.18）nmol/（min·g）]比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。两组肝臟和肌肉GS的蛋白表达比较差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.6 对GLUT的蛋白表达和mRNA表达的影响

检测喂养结束后大鼠肝脏、肌肉和脂肪组织中GLUT发现，与对照组比较，药物组GLUT的蛋白表达与mRNA表达均下调，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。

3 讨论

在慢性、难治性精神分裂症的治疗中，抗精神病药物长期维持治疗起着非常重要的作用。本研究建立长期给予奥氮平的大鼠模型，药物组摄食量、体重增长、FBG都高于对照组，提示长期给予奥氮平产生了一系列代谢相关不良反应，该结果与临床报道相符[6-7]。服药后食欲和体重增加是奥氮平常见的不良反应[2，9-10]，但体重增加只是糖代谢异常的危险因素之一[11]，糖代谢过程主要涉及胰岛素分泌和响应、葡萄糖摄取和利用等多个环节[12-13]，每一环节都可能在奥氮平作用下发生异常而引起糖稳态失衡。

本研究发现，长期给予奥氮平后，药物组大鼠FINS高于对照组，提示长期给予奥氮平并未抑制胰岛素分泌，但ISI低于对照组，HOMA-IR大于对照组，提示机体对胰岛素敏感性降低，产生了胰岛素抵抗倾向。胰岛素可以促进糖原合成[14]，但本研究中药物组FINS上升的同时糖原合成却减少，进一步提示在奥氮平长期诱导下机体产生胰岛素抵抗，对胰岛素敏感性和响应性降低。胰岛素抵抗时，体内胰岛素促进葡萄糖摄取和利用效率下降[15-16]。亲水性葡萄糖不能独自跨过细胞膜，必须由特殊的转运蛋白即GLUT带入细胞内，GLUT2主要存在于肝脏组织中，GLUT4在骨骼肌和脂肪组织中表达，GLUT性能改变可影响组织细胞对葡萄糖的摄取[17-18]。体内葡萄糖除氧化供能外，主要在肝脏和肌肉中合成糖原，维持机体糖稳态。GS是糖原合成的关键酶，在肌肉和肝脏中都有表达，当GS性能改变时，糖原合成减少，影响糖利用引起血糖波动[19-20]。

为进一步探讨奥氮平慢性治疗下糖稳态失调、胰岛素抵抗的内在原因，本研究以负责葡萄糖摄取的GLUT和参与糖原代谢利用的GS为研究对象，观察奥氮平对葡萄糖摄取和利用的影响。研究发现，长期给予奥氮平后，肝脏和肌肉组织中GS的蛋白表达无变化、蛋白活性增强，提示奥氮平的长期诱导不影响糖原合成。结合本研究中药物组糖原含量减少这一结果，推测奥氮平增加糖原分解能力大于促进糖原合成能力，因而血糖波动。此外，长期给予奥氮平后大鼠肝脏、肌肉、脂肪组织中GLUT的蛋白和mRNA表达均下降，推测奥氮平抑制了葡萄糖的正常摄取转运，影响细胞对糖的吸收利用，升高了血液中葡萄糖的浓度。

综上所述，在奥氮平长期诱导下，机体食欲和体重增加，组织中GLUT表达下调限制了细胞摄取葡萄糖，糖原分解增加破坏了体内糖稳态，产生胰岛素抵抗，造成血液中葡萄糖浓度高于正常值。奥氮平药源性高血糖不仅威胁着用药者的心血管健康，还会因此影响患者的治疗满意度和用药依从性，容易导致精神症状复发，增加个人、家庭及社会的负担。研究该类不良反应的内在机制对寻找奥氮平药源性高血糖防治靶点、开发新药物、实施个体化治疗防治奥氮平诱发高血糖、提高用药者的生活质量具有重要的科学和社会意义。

[参考文献]

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