长链非编码RNA AC003973.4对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响研究

郭文利 黄建棋 陆建菊 陆凯

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，也是我国女性第二位常见的恶性肿瘤，且近年来我国乳腺癌发病率呈迅速上升趋势[1]。一大部分乳腺癌患者被确诊时已处于癌症进展期，远处转移是乳腺癌患者死亡的主要原因，因此预防或减缓乳腺癌的进展和转移对于改善患者的预后有重要意义[2]。长链非编码RNA（lncRNA）在肿瘤发生、发展中的作用越来越受关注，lncRNA在多种肿瘤组织中表达失调，通过调控癌基因或抑癌基因的表达影响肿瘤的进展和转移[3-6]。AC003973.4是一个编码1 394个核苷酸的lncRNA。本研究通过检测AC003973.4在乳腺癌组织和细胞株中的表达情况，分析AC003973.4对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，探讨AC003973.4与乳腺癌进展和转移的关系，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料 RPMI 1640培养基、DMEM高糖培养基和FBS购自美国Gibco公司；人乳腺癌细胞株BT-549、MDA-MB-231、MCF-7、T47D和正常乳腺上皮细胞株MCF-10A均购自中国科学院细胞培养中心；过表达AC003973.4的质粒（pcDNA3.1-AC003973.4）和阴性对照质粒购自上海吉玛生物技术公司；Lipofectamine 3000脂质体转染试剂购自美国Invitrogen公司；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）试剂盒和引物购自上海生工生物工程公司；MTS试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；Transwell小室购自美国Corning公司；Matrige基质胶购自美国 BD 公司；抗 PTEN、CDK4、Cyclin D1、Zeb-1、N-cadherin及β-actin抗体均购自美国Santa Cruz公司。

1.2 实验标本 本研究经嘉兴市第一医院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。20例乳腺癌组织和配对的癌旁组织标本来源于2015年3月至2017年9月本院乳腺外科收治的行手术切除治疗的乳腺癌患者，癌旁组织取距肿瘤边缘＞1cm且＜3cm的组织。组织标本于手术切除后均迅速冷冻保存，且患者术前均未接受放化疗，术后病理学检查确诊乳腺癌。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养和转染 BT-549和MCF-7细胞培养于含10%FBS的RPMI 1640培养基，MDA-MB-231、T47D和MCF-10A细胞培养于含10%FBS的DMEM高糖培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养。选取对数生长期的MCF-7细胞进行转染，参照脂质体Lipofectamine 3000转染说明书进行操作。将MCF-7细胞以每孔4×105个接种于6孔板，待汇合度为60%时，分别将pcDNA3.1-AC003973.4质粒和阴性对照质粒转染至MCF-7细胞，分别为实验组和对照组，继续培养12h后更换新鲜培养基。

1.3.2 qRT-PCR 检测 AC003973.4、miR-224-5p和PTEN mRNA表达水平 使用Trizol试剂对组织和细胞进行RNA抽提。分光光度仪检测RNA浓度和纯度，将RNA逆转录为cDNA后进行qRT-PCR反应，分别以GAPDH和U6为内参，检测AC003973.4、miR-224-5p和PTEN mRNA的相对表达水平。qRT-PCR反应体系为：cDNA 2μl、混合液 10μl、上下游引物各 2μl、双蒸水2μl。反应条件为 94℃预变性 10min、59℃ 30s、72℃ 30s，共35个循环。AC003973.4的上游序列为 5′-TCTTTCCTCAGGAGGTATTGTGA-3′，下游序列为 5′-CACATCACCAAGGTTCTGGTT-3′；PTEN 的上游序列为 5′-AGGGACGAACTGGTGTAATGA-3′，下游序列为 5′-CTGGTCCTTACTTCCCCATAGAA-3′；GAPDH 的上游序列为 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游序列为5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；U6 的上游序列为 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游序列为 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-224-5p 的上游序列为 5′-GGGTCAAGTCACTAGTGGTTCC-3′，下游序列为 5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。

1.3.3 MTS法检测细胞增殖能力 取转染后状态良好的实验组和对照组MCF-7细胞，胰酶消化收集细胞，培养基调整细胞密度为 1×104个/ml，以 2×103个/孔重新接种于96孔板。使用MTS试剂盒检测细胞增殖能力，避光条件下，每孔加入浓度为15%的MTS试剂10μl，培养箱内继续培养2h，酶标仪检测各孔在450 nm波长处的光密度（D）值。以接种后12h为MTS实验的第0d，分别检测第0、1、2、3、4 d的细胞增殖能力。实验重复4次。

1.3.4 Transwell迁移实验检测细胞迁移能力 取转染后状态良好的实验组和对照组MCF-7细胞，胰酶消化收集细胞，使用无血清培养基调整细胞密度为1.5×105个/ml，将细胞悬液以 200μl/孔加入 Transwell上室，下室加入600μl含血清的培养基，培养箱中继续培养。24h后，取出上室，用95%的甲醇溶液固定，用0.1%

1.5 统计学处理 应用SPSS 21.0统计软件；计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织与癌旁组织、乳腺癌细胞株与正常乳腺上皮细胞株AC003973.4表达水平比较 见图1、2。

由图1可见，AC003973.4在乳腺癌组织中表达水平明显低于癌旁组织[（1.48±0.12）vs（5.53±0.24），P＜0.01]。由图2可见，AC003973.4在乳腺癌细胞株BT-549（0.41 ± 0.08）、MDA-MB-231（0.73 ± 0.04）、MCF-7（0.17± 0.04）和T47D（0.49± 0.04）中呈低表达，而在人正常乳腺上皮细胞株MCF-10A（1.00±0.07）中呈高表的结晶紫溶液染色，在倒置光学显微镜下观察，取4个视野（×100）计数基底膜细胞数，计算平均值。实验重复4次。

1.3.5 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力 在Transwell上室铺Matrige基质胶40μl/孔，培养箱内静置5h风干后，其余操作同Transwell迁移实验。

1.3.6 生物信息学法预测AC003973.4互补结合的miRNA及下游靶基因 采用LncBase Predicted v.2软件分析AC003973.4可互补结合的miRNA，采用TargetScan Release 7.2软件预测miRNA的下游靶基因。

1.3.7 Western blot法检测细胞PTEN蛋白、细胞增殖与迁移相关蛋白表达水平 取转染后状态良好的实验组和对照组MCF-7细胞，PBS溶液洗涤后，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取总蛋白，测定蛋白浓度。每组取45μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法将蛋白转至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶封闭。TBST溶液洗膜后加入Ⅰ抗冰箱内孵育过夜，Ⅰ抗稀释比例分别为PTEN（1∶1 000）、CDK4（1∶1 500）、Cyclin D1（1∶500）、Zeb-1（1∶500）、N-cadherin（1∶500）及 β-actin（1∶2 000）。TBST溶液洗膜后，加入Ⅱ抗室温孵育。TBST溶液洗膜后，加入显影液显影。β-actin为内参蛋白，实验重复4次。

1.4 观察指标 （1）比较乳腺癌组织与癌旁组织、乳腺癌细胞株与正常乳腺上皮细胞株AC003973.4表达水平；（2）比较实验组与对照组MCF-7细胞AC003973.4表达水平；（3）比较实验组与对照组MCF-7细胞增殖能力、迁移、侵袭能力；（4）观察AC003973.4互补结合的miRNA及下游基因预测结果；（5）比较实验组与对照组MCF-7细胞miR-224-5p、PTEN mRNA表达水平与PTEN、CDK4、Cyclin D1、Zeb-1、N-cadherin 蛋白表达水平。达，差异有统计学意义（均P＜0.05），在MCF-7细胞中表达水平最低（P＜0.01）。

图1 乳腺癌组织与癌旁组织AC003973.4表达水平比较（**P＜0.01）

图2 乳腺癌细胞株和正常乳腺上皮细胞株AC003973.4表达水平比较（与 MCF-10A 细胞株比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

2.2 实验组与对照组MCF-7细胞AC003973.4表达水平比较 见图3。

图3 实验组与对照组MCF-7细胞AC003973.4表达水平比较（**P＜0.01）

由图3可见，实验组MCF-7细胞AC003973.4表达水平明显高于对照组[（7.50±0.75）vs（1.02±0.10），P＜0.01]，即转染pcDNA3.1-AC003973.4质粒的MCF-7细胞AC003973.4的表达水平明显上调。

2.3 实验组与对照组MCF-7细胞增殖能力比较 见图4。

图4 实验组与对照组MCF-7细胞增殖能力比较（*P＜0.05，**P＜0.01）

由图 4 可见，第 1、2、3、4d，实验组 MCF-7 细胞的D 值分别为 0.42±0.03、0.63±0.03、1.02±0.07、1.21±0.06，对照组MCF-7细胞的D值分别为 0.59±0.05、0.90±0.07、1.47±0.06、1.58±0.07，实验组 MCF-7 细胞的 D 值均低于对照组（均P＜0.05），即上调AC003973.4的表达水平可减弱MCF-7细胞的增殖能力。

2.4 实验组与对照组MCF-7细胞迁移能力比较 见图5。

由图5可见，实验组MCF-7细胞的穿膜细胞数明显低于对照组[（126.70±15.47）个/视野vs（229.30±13.59）个/视野，P＜0.01]，即上调 AC003973.4 的表达水平可减弱MCF-7细胞的迁移能力。

图5 实验组与对照组MCF-7细胞迁移能力比较（a：光学显微镜下所见，结晶紫染色，×100；b：穿膜细胞数比较，**P＜0.01）

2.5 实验组与对照组MCF-7细胞侵袭能力比较 见 图6。

图6 实验组与对照组MCF-7细胞侵袭能力比较（a：光学显微镜下所见，结晶紫染色，×100；b：穿膜细胞数比较，*P＜0.05）

由图6可见，实验组MCF-7细胞的穿膜细胞数明显低于对照组[（37.33±8.32）个/视野vs（70.56±4.71）个/视野，P＜0.05]，即上调AC003973.4的表达水平可减弱MCF-7细胞的侵袭能力。2.6 AC003973.4互补结合的miRNA及下游基因预测结果 用LncBase Predicted v.2软件预测的结果表明，AC003973.4可互补结合miR-224-5p。TargetScan Release 7.2软件预测结果表明，miR-224-5p可互补结合的下游靶基因为 PTEN，mirSVR score 为-0.7800，Phast－Cons score为 0.5133，见图 7。

图7 AC003973.4互补结合的miRNA及下游基因预测结果

2.7 实验组与对照组MCF-7细胞miR-224-5p、PTEN mRNA表达水平比较 实验组MCF-7细胞miR-224-5p表达水平明显低于对照组[（0.30±0.07）vs（1.00±0.06），P＜0.01]，实验组MCF-7细胞PTEN mRNA表达水平明显高于对照组[（5.51±0.44）vs（1.00±0.06），P＜0.01]，即上调AC003973.4表达水平可抑制MCF-7细胞miR-224-5p的表达，促进PTEN mRNA的表达。

2.8 实验组与对照组MCF-7细胞PTEN、CDK4、Cyclin D1、Zeb-1、N-cadherin蛋白表达水平比较 见图8。

图8 实验组与对照组MCF-7细胞PTEN、CDK4、Cyclin D1、Zeb-1、N-cadherin蛋白表达水平比较（a：各蛋白电泳图；b：两组细胞各蛋白表达水平比较，**P＜0.01）

由图8可见，实验组MCF-7细胞PTEN蛋白表达水平高于对照组（P＜0.01），细胞增殖相关蛋白CDK4、Cyclin D1与细胞迁移相关蛋白Zeb-1、N-cadherin表达水平均低于对照组（均P＜0.01），即实验组MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭能力均减弱。

3 讨论

lncRNA是一类长度超过200个核苷酸、自身不编码蛋白的RNA，以往认为lncRNA没有实际作用，然而近来研究发现lncRNA在基因转录过程中发挥重要作用，可通过表观遗传学调控细胞功能[7-8]，在多种肿瘤组织中均发现表达异常的lncRNA，lncRNA可能广泛参与肿瘤的发生发展[9]。众多lncRNA如SNHG15、SNHG16、MEG3被发现在乳腺癌组织中表达上调或下调，在乳腺癌中发挥癌基因或抑癌基因作用[10-12]。AC003973.4是一种新发现的尚不清楚作用的lncRNA。

本研究结果表明，在乳腺癌组织和乳腺癌细胞株中AC003973.4的表达水平分别明显低于癌旁组织和正常乳腺上皮细胞。上调乳腺癌MCF-7细胞中AC003973.4的表达水平后，细胞增殖、迁移和侵袭能力均明显被抑制。以上结果提示，AC003973.4的异常表达可能参与调控乳腺癌的进展和转移。目前研究发现，lncRNA发挥作用的重要机制之一是通过吸附可互补结合的miRNA，减少下游miRNA的表达，发挥“海绵”作用[13]。miRNA是一类长度约为19～25个核苷酸的非编码RNA，可互补结合下游靶基因mRNA，干扰下游基因的表达[14-15]。lncRNA可通过减少miRNA的表达，干扰miRNA对下游靶基因的抑制作用。本研究应用LncBase Predicted v.2软件预测发现，AC003973.4可互补结合miR-224-5p。本研究上调MCF-7细胞AC003973.4表达水平后，miR-224-5p的表达降低，表明AC003973.4可能具有吸附miR-224-5p的作用。miR-224-5p在胰腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、宫颈癌中呈高表达水平，具有促进肿瘤细胞生长和转移的作用，表现为癌基因[14，16-17]。本研究利用TargetScan Release 7.2软件预测发现，miR-224-5p可互补结合PTEN。PTEN基因是目前发现的第一个具有脂质磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性的抑癌基因，其表达下调可干扰肿瘤细胞的细胞骨架重构[18]。PTEN是近年来抑癌基因研究的热点之一，在包括乳腺癌在内的人类大多数恶性肿瘤的发生、发展中发挥重要的调控作用[19]。上调PTEN基因的表达后，乳腺癌等肿瘤进展和转移明显减缓[20]。本研究结果表明，MCF-7细胞miR-224-5p表达下调后，PTEN基因的表达上调，PTEN蛋白表达上调的同时，细胞增殖相关蛋白CDK4和Cyclin D1的表达下调，细胞转移相关蛋白Zeb-1和N-cadherin的蛋白表达下调，表明MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭能力均下降。

综上所述，AC003973.4在乳腺癌组织和乳腺癌细胞中的表达下调，上调AC003973.4的表达可减弱MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭能力，其作用机制可能为AC003973.4吸附并降低miR-224-5p的表达，从而干扰miR-224-5p对PTEN抑癌基因的抑制作用。AC003973.4可能为乳腺癌进展和转移潜在的预测分子和治疗靶点。