分子荧光紧密内插法快速测定饲料中的硒

高向阳， 石珍奇

（郑州科技学院食品科学与工程学院，河南郑州450064）

硒是人体必需的微量元素，能提高机体免疫力，刺激免疫球蛋白及抗体的生成，增强机体对疾病的抵抗力。人体对硒的每日安全摄入量为50～200μg，过低会使人体免疫能力下降，引起胰脏疾病、癌症、肝病、糖尿病、心血管病、白内障、生殖系统疾病的发生，如果摄入量过多，则会引起中毒甚至死亡（王永华，2016；钟秀倩等，2015）。硒的摄入主要来自动植物膳食和水源，而富含硒的饲料，能提高动物自身的含硒水平，其产出的牛奶、蛋类、肉类产品硒含量也会随之增高，对人体健康产生影响，因此，测定饲料中的硒具有现实的积极意义。

硒的检测方法有氢化物一原子荧光光谱法（卫生部GB5009.93，2017）、分子荧光法（赵艳，2016；周跃花等，2009；杨雁玲，2007）、原子吸收光谱法（可成友等，2015；侯晓芳等，2009）、电感耦合等离子体-质谱法（陈永波等，2010）等，上述方法通常需要绘制工作曲线和测定空白溶液，操作繁琐，工作费时。紧密内插法又称双标准比较法，因其简便快速，大大提高了工作效率，已在饲料检测中得到应用（高向阳等，2017），但鲜见测定硒含量的文献报道。分子荧光紧密内插法利用在酸性条件下硒与2，3-二氨基萘（DAN）反应生成具有强荧光特性的4，5-苯并苤硒脑，其相对荧光强度与硒的含量成正比的原理，选择两个合适的硒标准溶液与试液在相同的条件下进行测定。该法将微波消解技术和分子荧光紧密内插法有效结合，为创建新型测定饲料中硒的方法提供了基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 仔猪前期配合饲料551、妊娠期母猪配合饲料556、仔猪后期母猪配合饲料552，由河南安必诺检测技术有限公司提供。

1.2 主要仪器与设备 101—1AS型电热鼓风干燥箱、DL—1型电子万用炉，北京市永光明医疗仪器有限公司；XT—9900A型智能微波消解—萃取仪，上海新拓分析仪器科技有限公司；PXSJ-216型离子计，上海仪电科学仪器股份有限公司；970CRT型荧光分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司。

1.3 主要试剂 盐酸、双氧水、环己烷、盐酸羟胺、浓氨水、浓硝酸、乙二胺四乙酸二钠盐、100μg/mL硒标准储备液，郑州派尼化学试剂厂；DAN（2，3-二氨基萘），东京化成工业株式会社；甲酚红，天津市福晨化学试剂厂。

1%（体积百分数）盐酸溶液：准确量取5 mL盐酸，用水稀释至500 mL，混匀。

1 g/L DAN试剂：准确称取0.1000 g DAN于锥形瓶中，加1%盐酸溶液100 mL溶解后加入20 mL环己烷震荡，移入分液漏斗分层，收集环己烷层的DAN溶液，反复用环己烷进行5次纯化，使DAN溶液中荧光降到最低，合并DAN溶液，储存于棕色瓶中，加入约1 cm厚的环己烷覆盖，于0～5℃冰箱中冷藏，备用（Serra等，2010）。

盐酸溶液（1+9）：浓盐酸和水按体积比1∶9混合后备用；氨水溶液（1+1）∶浓氨水和水按体积比1∶1混匀。

0.2 mol/L EDTA溶液：称取EDTA-2Na 37g，加水溶解，移入500 mL容量瓶定容，混匀。

100 g/L盐酸羟胺溶液：称取10g盐酸羟胺溶于水中，移入100 mL容量瓶定容，混匀。

0.2 g/L甲酚红指示剂：称取甲酚红指示剂50 mg溶于水中，滴加氨水溶液（1+1)1滴，移入250 mL容量瓶中定容，混匀。

EDTA混合液：取0.2 mol/L EDTA溶液及100 g/L盐酸羟胺溶液各50 mL，加0.2 g/L甲酚红指示剂5 mL，加水稀释至1 L，混匀。

1μg/mL硒标准使用液：吸取100μg/mL硒标准储备液5.00 mL，用1%盐酸溶液定容至500 mL，混匀，冷藏于冰箱中。

实验用水为怡宝水，电导率为2.82μS/cm；所用玻璃器皿均用1+5的硝酸溶液浸泡过夜，依次用自来水、怡宝水洗净后使用。

1.4 方法原理 根据发光强度与浓度在一定条件下呈正比的关系，用分子荧光紧密内插法测定并计算硒含量。该法只需比试液浓度较低和较高的两个标准溶液，与试液在相同条件下测定荧光相对强度，按公式（1）计算试液中硒的质量浓度，按公式（2）计算质量分数（mg/kg）。

式中：I1、I2为标准溶液的荧光相对强度；Ix为试液的荧光相对强度；ρx为试液的质量浓度，μg/mL；ρ1、ρ2为标准溶液的质量浓度，μg/mL（要求ρ2＞ρx＞ρ1）。

式中：m为干基样品的质量，g；ω为样品中硒的质量分数，mg/kg。

1.5 样品测定 样品经研磨、过80目尼龙筛、在80℃下干燥至恒重，称取0.3000 g（称准至0.0001 g）于消解罐内，加4 mL浓硝酸和1 mL双氧水，在加热板上加热至冒白烟后，按表1程序消解至澄清透明，放置室温后定量移入25 mL容量瓶中，用水定容。吸取5.00 mL于250 mL锥形瓶中，加EDTA混合液20.00 mL，滴加氨水溶液（1+1)或盐酸溶液（1+9）调pH至1.5。在暗室中加1 g/L DAN试剂4.00 mL混匀，80℃水浴6 min冷却，加6 mL环己烷震摇，移入分液漏斗中分层。将环己烷层倾入荧光液槽中，以387 nm为激发光，以514 nm为发射光，在与两个标准溶液完全相同的条件下测定荧光相对强度。

表1 微波消解程序

2 结果与分析

2.1 荧光激发波长的选择 取0.5μg/mL硒标准溶液5.00 mL于烧杯中，加20.00 mL EDTA混合液，滴加氨水溶液（1+1）或盐酸溶液（1+9）调pH至1.5。避光条件下加1 g/L DAN试剂4.00 mL，混匀，80℃水浴6 min冷却，移入分液漏斗中加6 mL环己烷震摇分层。环己烷层倾入荧光液槽，在仪器设定灵敏度为3、EX，EM狭缝均为10 nm、荧光发射波长520 nm条件下，选择300～600 nm激发光测定，结果表明：最佳荧光激发波长为387 nm。

2.2 荧光发射波长的选择 选择最佳荧光激发波长387 nm，设定发射波长为300～600 nm，在其他条件同2.1时进行光谱扫描，结果表明：最佳荧光发射波长EM为514 nm。

2.3 pH的最优选择 向5个烧杯中各加1 g/L的硒溶液5.00 mL、EDTA 20.00 mL，避光下加入4.00 mL DAN，在PXSJ-216型离子计上依次调节pH为1.0、1.5、2.0、2.5和3.0，沸水浴加热6 min，冷却至室温后，加6 mL环己烷震荡，分层后取环己烷层，以387 nm为激发光、514 nm为发射光测定，结果如表2。

由表2可知，在pH为1.5时测定的荧光相对强度最大。

表2 pH对硒标准溶液荧光值的影响

2.4 硒标准溶液浓度的选择 依次配制硒标准溶 液 0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 μg/mL 和0.60μg/mL，分别置于烧杯中，加EDTA 20 mL，调节pH至1.5。在暗室中加1 g/L DAN试剂4.00 mL混匀，80℃水浴6 min，冷却，移入分液漏斗中，加6mL环己烷震摇，分层。环己烷层在387 nm激发光、514 nm发射光下测定。

按照1.5操作测定饲料样品，试验表明，0.30μg/mL和0.50μg/mL硒标准溶液的荧光强度分别为39.73和40.41，试液的相对荧光强度在40左右，可满足I2＞Ix＞I1的要求，故选择0.30μg/mL和0.50μg/mL硒标准溶液进行紧密内插法操作。

2.5 DAN用量的确定 向5个烧杯中各加1 g/L的硒溶液5.00 mL、EDTA 20.00 mL，调节pH至1.5，在暗室中依次加1 g/L DAN试剂1.00、3.00、4.00、5.00 mL和6.00 mL混匀，80℃水浴6 min，冷却，移入分液漏斗中，加6 mL环己烷震摇，分层。在387 nm激发光、514 nm发射光下测定环己烷层的相对荧光强度，结果见表3。

表3 DAN试剂的用量对硒溶液荧光值的影响

由表3可知，DAN试剂用量为4.00 mL时荧光相对强度最强。

2.6 EDTA混合液的用量 EDTA混合液用量分别为15.00、20.00、25.00、30.00 mL和35.00 mL，取1 g/L的硒溶液5.00 mL，按试验步骤测定，结果见表4。

表4 EDTA混合液的添加量对硒标准溶液荧光值的影响

由表4可知，选择加入EDTA混合液20.00 mL较为合适。

2.7 水浴时间的确定 取1 g/L硒溶液5.00 mL，加DAN试剂4.00 mL、EDTA混合液20.00 mL，分别水浴3、6、9、12 min和15 min，按照试验方法测定，水浴6 min时荧光相对强度最强，结果见表5。

表5 水浴时间对硒标准溶液荧光值的影响

2.8 正交实验 由单因素实验，选择pH、EDTA混合液用量、DAN试剂用量、水浴时间四因素进行三水平的正交实验。因素水平如表6，正交实验结果如表7。

表6 因素水平表

表7 正交实验结果

由表7可知，最佳实验条件为A1B2C2D2，即pH至1.5、DAN试剂用量4.00 mL、EDTA混合液用量为20.00 mL、水浴时间为6 min。由R值可知，对硒测定结果影响的因素顺序为A＞D＞B＞C，即pH＞水浴时间＞DAN试剂用量＞EDTA混合液用量。

2.9 样品测定结果 在最佳实验条件下测定样品和标准溶液的相对荧光值，结果见表8。

表8 样品测定值

由表8可知，仔猪前期配合饲料551含硒5.83 mg/kg，妊娠期母猪配合饲料556含硒6.67 mg/kg。

2.10 加标回收率 分别向饲料中加入硒3.00、5.00μg和10.00μg进行回收率实验。按照分析方法测定和计算，结果如表9。由表9可知，加标回收率为92.7%～100%。

表9 加标回收率实验结果

3 结论

在硒最佳实验条件pH 1.5、EDTA混合液用量20.00 mL、DAN试剂用量4.00 mL、水浴时间6 min条件下，测得仔猪前期配合饲料551中硒含量为5.83 mg/kg，妊娠期母猪配合饲料556中硒含量为6.67 mg/kg，加标回收率为92.7%～100%。分子荧光紧密内插法具有快速简便、样品用量少、成本低廉、不需要测定空白溶液和绘制标准曲线的优点。