肾衰康灌肠液含药血清对HK-2细胞缺氧／复氧损伤的预防作用

邓荣荣， 罗芯怡， 叶乃菁， 吴新萍， 谢灯飘， 李明权

（1.成都中医药大学，四川成都 610075；2.成都中医药大学附属医院，四川成都 610075）

肾小管上皮细胞过度凋亡是急性肾损伤，尤其是缺血性急性肾损伤发生及恶化的重要机制[1-3］，氧化应激、内质网应激、炎症机制、钙超载等均有所参与。其中氧化应激可通过诱导肾小管上皮细胞活性氧簇爆发，启动细胞凋亡，参与肾脏缺血再灌注损伤[4］和急性肾损伤[5］，成为重要致病机制之一。

前期课题组发现，肾衰康灌肠液对缺氧／复氧损伤的人肾小管上皮细胞 （HK-2）凋亡具有明显抑制作用。因此，本实验基于 “治未病”思想，从细胞水平观察肾衰康灌肠液含药血清预防HK-2细胞缺氧／复氧损伤的效果，并基于氧化应激探讨其作用机制。

1 材料

肾衰康灌肠液 （浓缩型，海南天元制药厂，批号20130801）。HK-2细胞 （上海生物资源库）。ROS测定试剂盒 （货号 Ab39476）、 AKT （货号 4691 CST）、 NF-κB（货号6956 CST）、 MAPK （货号2532 CST） （英国 Abcam公司）；逆转录试剂盒 （美国Thermo Scientific公司）；荧光定量试剂盒、LC-96荧光定量PCR仪 （瑞士罗氏公司）。9只健康新西兰大白兔 （雄性5只、雌性4只）购自成都达硕实验动物有限公司，体质量 （2.2±0.2）kg，生产许可证号 SCXK（川）2013-17，使用许可证号 SYXK（川）2017-179，于成都中医药大学实验动物中心SPF级半屏蔽系统实验室以标准饲料分笼饲养，自由饮水，12 h明暗自动切换，保持温度 （20±2）℃、相对湿度 （60±5）%，适应性喂养7 d后开始实验。

2 方法

2.1 血清制备 将9只家兔按体质量随机分成空白组、PBS组、肾衰康灌肠液高剂量组，每组3只。空白组家兔正常喂养，不进行灌肠给药；PBS组家兔给予PBS缓冲液灌肠，剂量6.4 mL／（kg·d）；肾衰康灌肠液高剂量组家兔给予肾衰康灌肠液灌肠，剂量6.4 mL／（kg·d）（该剂量是按照人120 mL／d剂量与家兔体表面积的2倍换算得出），每天灌肠4次，每次间隔2～3 h，共3 d。第4天上午完成1次灌肠后，立即对各组家兔进行采血、离心、取上清、过滤除菌操作，得到相应血清，再进一步制备中剂量（50%高剂量含药血清+50%空白血清）、低剂量 （25%高剂量含药血清+75%空白血清）含药血清。

2.2 分组及造模 在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下，以含10%胎牛血清的DMEM／F12细胞培养液传代培养HK-2细胞。同步化24 h后，将细胞随机分为对照组、PBS组及含药血清高、中、低剂量组，其中对照组、PBS组用“2.1”项下含PBS血清培养，含药血清组用 “2.1”项下相应剂量含药血清培养。预处理24 h后，PBS缓冲液漂洗细胞，再换常规培养液培养，同时向PBS组、含药血清组加入 CoCl2原液（250 μmol／L） 以使其终浓度为 500 μmol／L，于37℃培养箱中孵育24 h，进行缺氧／复氧损伤造模。

2.3 细胞凋亡／死亡率检测 采用CFSE／PI染色、Annexin V-FITC／PI双染色、流式细胞分析，检测 “2.2”项下5组细胞造模后0、4、12、24 h凋亡／损伤情况。

2.4 细胞ROS水平检测 按 “2.2”项下方法常规培养HK-2细胞，同步化24 h后，随机分为空白组、模型组、预防组，其中空白组、模型组用 “2.1”项下PBS血清培养，预防组用 “2.1”项下高剂量含药血清培养。预处理24 h后，PBS缓冲液漂洗3组细胞，再换常规培养液培养，同时向模型组、预防组加入CoCl2，按 “2.2”项下方法造模。通过ROS荧光探针结合倒置显微镜，检测3组造模前后0、1、2、4、6、8 h细胞ROS水平。

2.5 AKT、NF-κB、MAPK mRNA表达检测 采用PCR技术，检测PBS组、含药血清组造模后0、4、8、12、24 h细胞AKT、NF-κB、MAPK mRNA表达，PCR引物由上海生物工程技术有限公司合成。其中，AKT正向 AGCGACG TGGCTATTGTGAAG，反向 GCCATCATTCTTGAGGAGGAAG T；NF-κB正向ATGTGGAGATCATTGAGCAGC， 反向CCTGGTCCTGTGTAGCCATT；MAPK正向 TACACCAACCTCTCGTACATCG，反向CATGTCTGAAGCGCAGTAAGATT，反应条件为94℃预变性2 min，94℃ 20 s，60℃ 45 s，循环40次，读取CT。然后，计算三者CT与内参基因β-actin CT之差ΔCT， 再与PBS组的 ΔCT相减得到 ΔΔCT， 最后通过公式 2T-ΔΔC测定含药血清组三者表达相对于PBS组的倍数。

2.6 统计学分析 通过SPSS13.0软件进行处理，数据用s）表示，2组间比较采用Student t检验；多组间比较方差齐者采用单因素方差分析，不齐者采用秩和检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 缺氧／复氧损伤对HK-2细胞ROS水平的影响[6］图1显示，造模后细胞ROS荧光强度明显高于造模前，表明以CoCl2进行缺氧／复氧损伤造模时可引起HK-2细胞ROS积聚，诱导细胞发生氧化应激反应。

图1 缺氧／复氧损伤对HK-2细胞ROS水平的影响

3.2 含药血清对HK-2细胞CFSE／PI染色的影响 图2～6显示，造模后0 h，各组细胞尚未发生凋亡／损伤；造模后4～12 h，各组细胞凋亡／死亡率明显增加，但含药血清组明显低于对照组、PBS组，并以高剂量组最低；造模后24 h，对照组、PBS组、含药血清低剂量组仍有较低水平的细胞凋亡／损伤存在，而高、中剂量组已回到正常水平。

图2 含药血清对HK-2细胞CFSE／PI染色的影响 （0 h）

图3 含药血清对HK-2细胞CFSE／PI染色的影响 （4 h）

图6 含药血清对HK-2细胞CFSE／PI染色的影响（0～24 h）

3.3 含药血清对HK-2细胞凋亡／死亡率的影响 图7～8显示，造模后0 h，各组细胞均主要分布于双染阴性左下象限，即细胞凋亡／损伤尚未出现；造模后12 h，各组细胞凋亡分布明显增多，但含药血清中、高剂量组表现出明显的抑制作用 [凋亡／死亡率为中剂量组 （20.9±0.7）%、高剂量组 （18.4±0.7）%， 显著低于对照组的 （28.1±2.2）%、PBS组的 （27.7±2.5）%， P＜0.05）； 造模后 24 h， 对照组、PBS组能检测到明显细胞凋亡，凋亡／死亡率为（22.5±2.2）%，而含药血清组细胞凋亡已降至较低水平，低、中、高剂量下凋亡／死亡率分别为（10±0.9）%、 （7.7±0.7）%、（6.6±0.7）% 。

图7 含药血清对HK-2细胞凋亡／死亡率的影响 （Ⅰ）

图8 含药血清对HK-2细胞凋亡／死亡率的影响 （Ⅱ）

3.4 含药血清对HK-2细胞ROS水平的影响 图9显示，各组在造模前均未发现细胞绿色荧光，即均处于氧化还原平衡状态；造模后模型组细胞出现大量绿色荧光，表明造模可引起ROS水平明显增高，细胞发生氧化应激反应。其中预防组明显少于模型组。图10显示，预防组、模型组均在造模后0 h即达到ROS水平峰值，随后均逐渐减少至消失，但预防组在造模后4 h即基本恢复至正常，而模型组需在造模后8 h。

3.5 含药血清对HK-2细胞AKT、NF-κB、MAPK mRNA表达的影响 图11显示，与PBS组比较，造模后0～4 h含药血清组 AKT、NF-κB、MAPK mRNA表达下降，4～12 h逐渐升高，而且对NF-κB、MAPK mRNA表达呈现一定剂量依赖性，与PBS组比较有显著差异 （P＜0.05）。

4 讨论

急性肾损伤是一种临床上常见的综合征[7］，其中急性肾小管坏死主要由缺血和中毒引起，缺血性可占发病的75%[8］。缺血再灌注性肾损伤是引发缺血性急性肾损伤的重要机制之一，但由于现代医学对其缺乏切实有效的治疗方法，不仅导致病死率高达50%以上[9］，而且有相当数量的患者最终进展为终末期肾病，需长期替代治疗。

图9 造模前后各组HK-2细胞ROS水平比较

肾衰康灌肠液由大黄、黄芪、丹参、红花组成，作为以急性肾损伤为适应证的唯一应用于临床的纯中药制剂，临床疗效确切。前期课题组发现，肾衰康灌肠液含药血清可抑制缺氧／复氧损伤后HK-2细胞凋亡，但它是否对缺氧／复氧损伤诱导HK-2细胞凋亡具有预防作用尚不明确。故本实验通过CFSE／PI染色、Annexin V-FITC／PI双染色结合流式细胞分析、ROS荧光检测、PCR技术，从细胞、基因层面进行考察。

图10 造模后模型组、预防组HK-2细胞ROS水平比较

图11 含药血清对HK-2细胞AKT （A）、NF-κB （B）、MAPK （C） mRNA表达的影响

细胞凋亡是Kerr等[10］在1972年提出的有别于细胞坏死的细胞程序性死亡，而氧化应激是导致细胞病理性过度凋亡的主要机制之一，它可通过ROS等氧化损伤线粒体功能及结构[11］、 升高胞浆内 Ca2+浓度[12］、 激活某些死亡基因程序 （如Bax、P53等）[13］等途径来导致细胞过度凋亡。本实验发现，肾衰康灌肠液含药血清对缺氧／复氧损伤诱导HK-2细胞凋亡具有明显预防作用，并呈现剂量依赖性，即高剂量下效果最强。ROS检测发现，肾衰康灌肠液含药血清预处理对缺氧／复氧损伤诱导HK-2细胞氧化应激反应具有明显抑制作用，具体表现为细胞ROS集聚明显减少，而且经PCR检测发现它对与ROS调节相关的AKT、NF-κB、MAPK等通路[14-15］具有一定调控作用。

综上所述，肾衰康灌肠液含药血清可预防HK-2细胞缺氧／复氧损伤，其机制可能与抑制细胞氧化应激、减少细胞ROS过量聚积有关。