转染miRNA-145、黏结合蛋白多糖-2 siRNA对膀胱癌T24细胞增殖、分化的影响

李雨晴,刘红春,朱 峰)

1)河南中医药大学第二临床学院检验科 郑州 450046 2)郑州大学第一附属医院检验科 郑州 450052 3)郑州大学检验系 郑州 450052

膀胱癌指发生在膀胱黏膜的恶性肿瘤, 可发生于任何年龄，发病率、死亡率高，男性膀胱癌发病率为女性的3～4倍[1]。研究膀胱癌的发病机制，找到可诊断和治疗膀胱癌的生物标志物尤为重要。微小RNA(miRNA)是一种大小为18～25个核苷酸的非编码RNA，它通过抑制蛋白质翻译或促进mRNA降解来调节基因的表达，进而调控细胞的增殖、分化、凋亡等[2]。黏结合蛋白多糖-2(syndecan-2)属于硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)家族，在绝大多数上皮和非上皮源性肿瘤中表达。多配体蛋白聚糖家族广泛参与细胞的增殖、分化、血管生成等，与癌症的发生发展密切相关[3]。有研究[4-7]表明，一些miRNA可以调控HSPG的合成和降解，从而影响HSPG的表达，参与肿瘤的发展。本研究旨在探讨miRNA-145对膀胱癌细胞中syndecan-2的调控作用及对细胞增殖、分化的影响。

1 材料与方法

1.1细胞、主要试剂与仪器人膀胱移行细胞癌细胞株T24购自盖宁生物公司。转染脂质体RNAi-MAX、miRNA-145前体购自美国Thermo Fisher Scientific公司，总RNA提取试剂盒和反转录试剂盒购自北京天根公司，荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，引物和syndecan-2 siRNA由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，细胞增殖检测试剂盒购自美国Promega公司，细胞衰老检测试剂盒购自美国Abnova公司，凋亡检测试剂盒购自美国Millipore公司。ABI 7500全自动荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)，Nikon50i显微镜图文系统(日本Nikon公司)。

1.2细胞培养T24细胞培养于无血清细胞培养基，添加含体积分数15%胎牛血清和青链霉素双抗，于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养。

1.3转染miRNA-145对T24细胞增殖、分化的影响(实验Ⅰ)

1.3.1 实验分组 T24细胞分为2组，空白对照组不处理；转染miRNA-145组根据转染说明书，使用脂质体RNAi-MAX转染，加入miRNA-145前体，以提高miRNA-145的表达。

1.3.2 细胞增殖检测 转染24、48和72 h后，采用MTT法检测2组细胞492 nm处的吸光度并在镜下观察细胞增殖情况。实验重复3次，下同。

1.3.3 细胞中syndecan-2及多种细胞分化标志物mRNA表达的检测 转染72 h后在倒置显微镜下观察细胞形态；采用荧光定量PCR检测2组细胞中syndecan-2，鳞状细胞标志物(P63、TP73和CK5)，腺状细胞标志物(MUC-1、MUC-3)，神经内分泌细胞标志物(NSE、UCHL-1、CGA)，干细胞标志物(NANOG、OCT3、 SOX2和 E2F4)mRNA的表达。引物序列见表1。用RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录为cDNA，-80 ℃保存。反应体系:cDNA 2 μL，上、下游引物各0.4 μL, ROX Reference Dye(50×)0.1 μL，SYBR Premix Ex Taq(2×)(Til RNaseH Plus)10 μL, dH2O 7.1 μL。循环参数:95 ℃30 s;95 ℃5 s, 60 ℃34 s, 共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的mRNA的相对表达量。

表1 基因引物序列

1.4转染syndecan-2siRNA对T24细胞衰老、凋亡及分化的影响(实验Ⅱ)

1.4.1 细胞分组 T24细胞分为2组，空白对照组不处理；转染syndecan-2 siRNA组参考1.3.1中转染方法，转染100 ng/L syndecan-2 siRNA。syndecan-2 siRNA序列是5’-GAAGACTGCTCCGGACCTAGC-3’。

1.4.2 细胞衰老和凋亡检测 ①采用衰老相关β-半乳糖苷酶法检测细胞衰老，按照细胞衰老检测试剂盒说明书操作。转染72 h后，吸取2组细胞各1 mL，用PBS洗涤3次后弃上清，按照细胞衰老检测试剂盒说明书，加入染色固定液，室温固定15 min后用PBS漂洗3次，弃上清，加入染色工作液，37 ℃孵育过夜。显微镜下观察，计数高倍镜下100个细胞中蓝染细胞(衰老细胞)个数，计算细胞衰老率。②采用TUNEL法检测细胞凋亡，按照凋亡检测试剂盒说明书操作。转染72 h，收集2组细胞制备细胞涂片，室温固定20 min，PBS漂洗3次，每次5 min，加封闭液，再漂洗，浸入细胞膜通透液，漂洗后进行标记反应，最后DAB显色，中性树胶封片，显微镜下观察，整个实验在避光条件下进行。计数高倍镜下100个细胞中染成棕色的细胞(凋亡细胞)个数，计算细胞凋亡率。

1.4.3 细胞中syndecan-2及细胞分化标志物mRNA表达的检测 转染72 h后，参照1.3.3方法检测2组细胞中syndecan-2及MUC-1、TP73、NANOG、NSE mRNA的表达。

1.5统计学处理用SPSS 22.0处理数据。采用2×3析因设计的方差分析比较实验Ⅰ2组细胞增殖能力的差异，采用两独立样本t检验比较实验Ⅰ和实验Ⅱ转染组细胞与空白对照组其他指标的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1实验Ⅰ2组细胞增殖检测随转染时间的延长，2组细胞吸光度升高；与空白对照组比较，转染miRNA-145组吸光度降低(表2)。

表2 实验Ⅰ细胞增殖情况比较

F组间=34.105，P<0.001；F时间=46.834，P<0.001；F交互=8.562，P<0.001

2.2实验Ⅰ2组细胞形态学表现及细胞分化标志物、干细胞标志物mRNA表达的比较与空白对照组相比，转染miRNA-145组细胞在转染72 h后出现类似腺状细胞的膨胀细胞质及类似神经内分泌细胞的细长轴突(图1)；同时，鳞状细胞标志物(P63、TP73和CK5)，腺状细胞标志物(MUC-1、MUC-3)，神经内分泌细胞标志物(NSE、UCHL-1、CGA)及干细胞标志物(NANOG、OCT3、SOX2和 E2F4)mRNA的表达均增加(表3、4)。空白对照组和转染miRNA-145组syndecan-2 mRNA的表达水平分别为(1.00±0.19)和(0.52±0.16)，差异有统计学意义(t=3.347,P=0.029)。

A:空白对照组；B:转染miRNA-145组腺状细胞样改变；C：转染miRNA-145组神经内分泌细胞样改变

组别鳞状细胞标志物TP73P63CK5腺状细胞标志物MUC-1MUC-3神经内分泌细胞标志物NSEUCHL-1CGA空白对照组1.00±0.121.00±0.321.00±0.541.00±0.891.00±0.191.00±0.661.00±0.281.00±0.16转染miRNA-145组1.65±0.182.03±0.285.87±1.084.73±1.151.94±0.292.59±0.381.94±0.351.67±0.33t5.2044.1966.9864.4434.6963.6163.6323.164P0.0060.0140.0020.0110.0090.0220.0210.034

表4 实验Ⅰ转染72 h后 干细胞标志物mRNA表达的比较(n=3)

2.3实验Ⅱ2组细胞syndecan-2表达的比较空白对照组和转染syndecan-2 siRNA组syndecan-2 mRNA的表达水平分别为(1.00±0.05)和(0.49±0.04)，差异有统计学意义(t=13.796,P<0.001)。

2.4实验Ⅱ2组细胞衰老和凋亡情况转染72 h后，与空白对照组相比，转染syndecan-2 siRNA组衰老细胞增多，见图2、表5。

A:细胞衰老;B:细胞凋亡;1:空白对照组;2:转染syndecan-2 siRNA组

2.5实验Ⅱ2组细胞分化标志物和NANOGmRNA表达的比较转染syndecan-2 siRNA组细胞主要分化标志物和干细胞分化标志物NANOG mRNA的表达增加(表6)。

表6 实验Ⅱ2组细胞 分化标志物mRNA表达的比较(n=3)

3 讨论

膀胱癌占我国泌尿生殖系肿瘤发病率和死亡率的第一位，深入研究膀胱癌发生、发展相关的标志物，有助于加深对该病的认识，同时也能为寻找新的治疗手段提供理论依据[8]。

miRNA-145是miRNA中的一种，位于人5号染色体长臂的3区2带(5q32)[9]，它在结直肠癌、肺癌、前列腺癌和食管癌中的表达降低[10-15]，可能是一种肿瘤抑制物。有研究[16]表明miRNA-145可通过抑制某个靶点而抑制原癌基因的激活，而原癌基因被激活后也可抑制miRNA-145的表达，使其不能发挥正常功能。miRNA-145能够抑制多种癌基因表达从而抑制癌细胞的增殖、侵袭、转移，在肺腺癌中抑制表皮生长因子和NUDT1[17]，在食管鳞状细胞癌中抑制Fascin-1[18]、在肝癌中抑制胰岛素样生长因子[19]。该研究结果显示上调miRNA-145后T24细胞增殖能力减弱，说明其在膀胱癌增殖、发展中起负性调节作用，这与之前的研究结果一致。此外，研究结果还显示， miRNA-145能使T24细胞分化为具有干细胞特征的多能细胞，这也印证了前人关于miRNA有将癌细胞重新诱导为干细胞样细胞的潜能的报道[20]。

此外，本研究结果显示上调miRNA-145后T24细胞中syndecan-2表达下降。syndecan-2是一种跨膜蛋白多糖，是HSPG家族中的一员，其核心蛋白部位的多功能区与糖胺聚糖链的胞外配体及胞膜受体相结合，介导胞内外信号传导，与肿瘤的分化、发展密切相关[21]。syndecan-2从肿瘤细胞表面脱落，其N端的亮氨酸残基可被MMP-7剪切[22]，脱落在培养基或基质中的胞外段能提高癌细胞黏附和侵袭能力。有研究[23]表明syndecan-2在结肠癌细胞株中处于高表达状态，蛋白表达越高，癌细胞侵袭力越强。另有研究[24]显示syndecan-2对于肿瘤发生和前列腺肿瘤干细胞的再生至关重要。在乳腺癌中miRNA-145能够调控syndecan-2的表达，影响乳腺癌细胞的迁移[25]。本研究结果显示，转染siRNA建立稳定沉默syndecan-2的细胞株后，细胞主要分化标志物和NANOG mRNA的表达增加，细胞发生衰老，说明下调syndecan-2的表达可诱导细胞衰老和分化。

综上所述，在膀胱癌T24细胞株中转染miRNA-145，可下调syndecan-2表达，诱导细胞衰老和分化，从而抑制肿瘤增殖。