抑制组织蛋白酶B表达对骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响

孙坚皓，孙建广，黄世磊，马招鑫，皮国富

郑州大学第一附属医院骨科 郑州450052

组织蛋白酶B(cathepsin B，CB)是一种与木瓜蛋白酶结构相似的溶酶体半胱氨酸蛋白酶，其在肿瘤生长、侵袭、转移和血管生成中发挥重要作用[1-3]，并在多种肿瘤细胞(如胃癌[4]、肺癌[5]、结直肠癌[6]、食管癌[7]及前列腺癌[8])中呈现高表达，参与肿瘤的侵袭转移过程；有研究[9]表明CB在骨肉瘤细胞中也呈现高表达。本实验运用小干扰RNA(siRNA)特异性下调骨肉瘤细胞MG63中CB的表达，观察其对骨肉瘤MG63细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1主要材料人骨肉瘤MG63细胞购自中国科学院上海生物化学与细胞生物研究所，Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司，SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、ECL化学发光试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，鼠抗人CB单克隆抗体和兔抗人α-tubulin单克隆抗体购自美国Abcam公司，CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所，8.0 μm孔径Transwell小室购自美国Corning公司，Matrigel基质胶购自美国BD公司。阴性对照siRNA(NC-siRNA)、靶向CB基因的siRNA序列1～3(CB-siRNA1～3)由广州锐博有限公司设计合成。

1.2细胞分组、培养及转染将人骨肉瘤MG63细胞分成空白对照组、siRNA-1组(转染CB-siRNA-1)、siRNA-2组(转染CB-siRNA-2)、siRNA-3组(转染CB-siRNA-3)和NC组(转染NC-siRNA)5组。取处于对数生长期的各组细胞，以2×105个/孔的密度接种于6孔板中，均在含有体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基中于37 ℃、体积分数5%CO2、相对饱和湿度为95%的培养箱中培养，当细胞密度达60%～70%时按siRNA转染说明书进行相应的转染。每组均设6个复孔。

1.3各组细胞中CB蛋白表达的Westernblot检测细胞转染48 h后，提取细胞总蛋白，采用BCA法(按试剂盒说明书步骤进行)测定蛋白浓度后煮沸变性，按照试剂盒说明制备SDS-PAGE凝胶并进行电泳，电泳结束后将蛋白转至PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉液室温封闭1 h，加入鼠抗人CB单克隆抗体(按1∶1 200稀释)、兔抗人α-tubulin单克隆抗体(按1∶2 000稀释)4 ℃环境下过夜孵育，TBST洗3遍，5 min/次。加入HRP标记的二抗(分别按1∶2 000、1∶5 000稀释)孵育1 h。TBST洗3遍，5 min/次。于暗室内用化学发光ECL显影液显示蛋白条带。应用Image J软件计算各蛋白灰度值，计算蛋白相对表达量。

1.4各组细胞增殖活力的检测采用CCK-8法，将处于对数生长期的细胞分为空白对照组和siRNA-2组接种于96孔板，每组设6个复孔，6×103个/孔。分组转染后，分别在0、24、48、72和96 h后换液，并加入CCK-8试剂，继续在培养箱中孵育2 h，用酶标仪测定450 nm波长吸光度值。

1.5各组细胞的克隆形成实验将处于对数生长期的细胞分为空白对照组、siRNA-2组、NC组3组，给予相应处理，每组设6个复孔。10 d后用40 g/L的多聚甲醛固定20 min，1.25 g/L结晶紫甲醇溶液染色2 min，PBS清洗残留染色液后拍照，并计算细胞数>50个的克隆数。实验重复3次。

1.6各组细胞划痕愈合实验在6孔板板底用记号笔水平划5条互相平行的定位线。将处于对数生长期的细胞分为空白对照组、siRNA-2组、NC组3组接种于该6孔板，每孔2×105个细胞，给予相应处理。培养至细胞密度为90%～100%时，用200 μL移液枪枪头于每孔中线垂直于定位线做划痕，然后每孔加2 mL无血清培养基继续培养细胞。于划痕后0、6和12 h在倒置显微镜下定点拍照，然后用Image J软件分别计算0、6、12 h后的划痕面积。用[0 h划痕面积分别-6(或12 h)划痕面积]/0 h划痕面积×100%计算划痕愈合率。实验重复3次。

1.7各组体外侵袭实验将Matrigel胶用DMEM培养基按1∶8稀释，每个小室加入稀释液50 μL，在37 ℃培养箱内恒温放置30 min。取空白对照组、siRNA-2组、NC组转染后72 h的细胞，常规胰蛋白酶消化后计数，调整细胞密度为5×105个/L，每孔取100 μL细胞悬液接种于上室，下室每孔加入500 μL含体积分数20%胎牛血清培养基，培养48 h后取出小室，用40 g/L多聚甲醛固定20 min，1.25 g/L结晶紫甲醇溶液染色2 min，棉签拭去上室面细胞，PBS清洗残留染色液，100倍倒置显微镜下每孔选取上、下、左、右、中5个视野拍照并计数。实验重复3次。

1.8统计学处理采用SPSS 23.0进行分析，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较各组MG63细胞中CB蛋白表达、细胞增殖能力、细胞克隆形成能力、细胞划痕愈合率和细胞侵袭能力的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组MG63细胞中CB蛋白的表达比较见图1。由图1可知，siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组CB蛋白相对表达量分别为(0.498±0.012)、(0.198±0.025)和(0.625±0.006)，空白对照组及NC组分别为(2.004±0.013)和(1.596±0.057)，各组间比较差异有统计学意义(F=441.768，P<0.001)，其中siRNA-2组CB蛋白相对表达量最低，故将siRNA-2用于后续实验。

2.2各组MG63细胞增殖能力的比较见表1。

2.3各组MG63细胞克隆形成实验结果siRNA-2组细胞克隆形成数(74.3±4.5)明显低于空白对照组及NC组[(103.0±10.1)和(109.7±14.6)]，差异有统计学意义(F=9.450，P<0.001)。

1：NC组；2：siRNA-3组；3：siRNA-2组；4：siRNA-1组；5：空白对照组

图1 各组MG63细胞中CB蛋白的表达

2.4各组MG63细胞划痕愈合实验结果见表2。

表2 各组MG63细胞划痕愈合率 %

*：与其他两组比较，P<0.05

2.5各组MG63细胞体外侵袭实验结果见图2。siRNA-2组细胞侵袭数(48.6±9.5)与空白对照组(93.6±12.1)及NC组(102.4±21.1)相比差异有统计学意义(F=34.677，P<0.001)。

A：空白对照组；B：siRNA-2组；C：NC组

3 讨论

目前对骨肉瘤发病、转移及复发的分子机制研究尚未完善，蛋白质的异常表达是恶性转化的重要特征。组织蛋白酶家族在多种肿瘤组织中特异性高表达；组织蛋白酶D(CD)被认为是潜在的目标蛋白，CD在骨肉瘤肺转移和化疗耐药中的表达增加表明CD在OS的病理过程中具有重要作用[10]，同时CD可以激活CB[11]；降低骨肉瘤细胞组织蛋白酶K(CK)的表达后可显著降低其增殖、侵袭能力[12]。以上可以看出组织蛋白酶家族在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。

RNA干扰(RNAi)是双链核糖核酸(dsRNA)特异性调节基因活性的天然过程，它以特异性沉默靶基因表达为特征，在疾病治疗中具有很大的潜在应用价值[13-14]。本实验运用脂质体将合成的CB-siRNA转染入MG63细胞中，实验结果显示，与空白对照组和NC组相比，CB-siRNA转染组CB表达量下降，说明CB-siRNA能特异且有效地抑制CB的表达。后续实验结果表明，抑制CB表达后MG63细胞增殖能力明显减弱，证明CB可促进骨肉瘤细胞的增殖。有研究[15]表明，抑制CB后子宫内膜癌细胞的增殖能力也减弱，与本文结果相一致。肿瘤细胞的迁移能力是转移至继发部位所必需的，本实验细胞划痕实验结果表明抑制CB表达后，MG63细胞的迁移能力明显减弱，说明CB对骨肉瘤细胞的迁移起积极作用。有研究[16]报道，在前列腺癌中降低CB表达后细胞迁移能力也降低，与本实验结果相一致。肿瘤的侵袭是其发生远处转移的关键步骤，研究[17]表明，肿瘤的侵袭发生在低pH区域，酸性胞外环境能够诱导溶酶体迅速转移至细胞外周，导致溶酶体胞吐增加，分泌大量的CB，CB作用于基膜，促使基膜蛋白Ⅳ型胶原的降解增加，从而促进肿瘤的侵袭及转移。本研究中Transwell实验结果显示，下调CB表达后MG63细胞的穿膜数明显减少，说明沉默CB后MG63细胞的侵袭能力明显降低，也证明了CB参与骨肉瘤的侵袭过程。有研究表明，下调一些肿瘤细胞(子宫内膜癌[15]、前列腺癌[16]、乳腺癌[18])CB表达后，其细胞侵袭能力亦明显降低，与本研究结果一致。以上结果证明，CB可以促进骨肉瘤细胞的恶性行为，参与骨肉瘤的增殖、迁移及侵袭过程，因此CB有望成为骨肉瘤基因治疗的有效靶点。

综上所述，CB参与了骨肉瘤的恶性进展，有可能成为治疗骨肉瘤的潜在靶点。但是，该研究也存在不足之处，如仅从细胞学方面证明了CB在骨肉瘤中的作用，因此，下一阶段作者将进行体内实验进一步验证本实验结论。