胭脂萝卜硫素微胶囊制备工艺优化

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(长江师范学院现代农业与生物工程学院,重庆 408100)

萝卜硫素又称“莱菔子素”,分子式C6H11S2NO,是葡萄糖莱菔子苷降解后的一种产物,是植物中发现的最强的抗癌成分之一[1]。萝卜硫素可抑制I相酶的致癌活性,同时激活II相酶的解毒功能,并可与多种致癌物作用,所以在治疗癌症,如:肝癌、胃癌、鼻咽癌、乳腺癌等方面有着重要意义[2-4]。萝卜硫素对光、温度、酸碱等条件较为敏感,在保藏过程中容易丧失活性,因此将其微囊化有利于提高萝卜硫素的稳定性,从而更有效地实现萝卜硫素抗癌、抗氧化、抑菌、神经保护等方面的生物活性[5-6]。

但目前国内对于萝卜硫素的研究主要集中在提取、纯化、抗癌活性、抑菌活性等方面[7],而有关萝卜硫素微胶囊研究较少。例如:马建华[8]选用胶和β-环糊精、乳清蛋白和麦芽糊精或小牛血清制作成复合壁材,采用喷雾干燥法制备了一种萝卜硫素微胶囊。郭春静等[9]采用薄膜分散法制备了姜黄素和萝卜硫素共包载脂质体。吴元峰等[10]制备了萝卜硫素/羟丙基-β-环糊精包合物,并研究了萝卜硫素及其包合物的热降解动力学规律。这些研究所制备的微胶囊能够在一定程度上提高萝卜硫素的稳定性,但其缓释效果和避光效果不佳。仙草胶是一种酸性多糖,具有耐酸、耐碱、耐热、避光性强等优点[11]，属于弱凝胶,自身很难独立成胶。如果将它与变性淀粉混合,能形成的结构致密的凝胶,将这种凝胶作为壁材,能制备出包埋率高、缓释效果好的胭脂萝卜硫素微囊。

本文采用乳化-凝胶法,以仙草胶-变性淀粉为壁材,对胭脂萝卜硫素进行包埋,以期提高胭脂萝卜硫素的稳定性和缓释性,从而最大限度地保留其生物活性,促进其生理功能的发挥。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

胭脂萝卜 市售,仙草胶厦门顺祥泰有限公司;萝卜硫素标品 上海纯优生物科技有限公司;变性淀粉 青州市北联淀粉有限公司;人工胃液、人工肠液 北京雷根生物技术有限公司;聚氧乙烯辛基苯酚醚-10(OP-10) 湖北鑫润德化工有限公司;二氯甲烷、碳酸钠 分析纯,重庆化学试剂厂。

JJ-1B恒速增力电动搅拌器 金坛市城东新瑞仪器厂;UB102i正置生物显微镜 重庆澳浦光电技术有限公司;EL204电子分析天平、PE20 pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 金坛市荣华仪器制造有限公司;ZHWY-200B恒温培养振荡器、ZFD-5040全自动鼓风干燥箱 上海智诚分析仪器制造有限公司;UV-1800紫外可见分光光度计 日本岛津仪器有限公司;IB-3型离子镀金仪 Eiko公司;JSM-6390LV电子扫描电镜 JEOL公司。

1.2 实验方法

1.2.1 胭脂萝卜硫素粗提物的制备 采用阳晖等[12]的方法,略有修改,制备胭脂萝卜硫素粗提物。取5 kg新鲜胭脂萝卜洗净,切丁、打浆,然后添加0.2 mg/kg的VC作为催化剂,再用磷酸缓冲液将pH调至5.5,利用胭脂萝卜中自身的内源酶酶解8 h,在40～50 ℃下烘干至基本无水分,粉碎过40目筛,备用。然后将胭脂萝卜粉末用二氯甲烷,在25 ℃条件下超声萃取0.5 h,将萃取液在40 ℃条件下进行抽滤2次后,得到萝卜硫素粗提物。其萝卜硫素含量为(0.61±0.07) mg/mL。

1.2.2 胭脂萝卜微胶囊的制备 将仙草胶4 g溶解于50 mL 0.5%碳酸钠溶液中,加热至80 ℃并不断搅拌,形成均匀溶液后冷却至35 ℃;然后加入一定比例的变性淀粉于上述溶液,并放入80 ℃水浴中充分糊化[13],随后调节溶液pH至5,加入一定比例的胭脂萝卜硫素粗提物,搅拌均匀。再加入一定量的乳化剂OP-10和20 mL二氯甲烷,低速搅拌,乳化一定时间后放入40 ℃的水浴中,固化2 h至二氯甲烷挥发完全。然后过滤,再分别用二氯甲烷洗涤和蒸馏水洗涤2遍,再过滤,测定滤液中硫素含量,计算包埋率。将收集的萝卜硫素微胶囊在40～50 ℃下鼓风干燥8 h。最后研磨成粉,过100目筛。用光学显微镜观察微胶囊的形态,并用测微尺测定粒径大小,扫描电镜观察其表面微观形态。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 壁材比例对胭脂萝卜硫素微胶囊包埋效果的影响 在壁芯质量比为5∶1(全文均为质量比),pH为5,OP-10添加量为0.5%,乳化时间为30 min,搅拌速度为300 r/min的条件下,改变壁材比例(仙草胶∶变性淀粉)为3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1,研究壁材比例对胭脂萝卜硫素微胶囊成囊效果和包埋率的影响。

1.2.3.2 壁芯比对胭脂萝卜硫素微胶囊包埋效果的影响 在壁材比例为4∶1,pH为5,OP-10添加量为0.5%,乳化时间为30 min,搅拌速度为300 r/min的条件,改变壁芯比为3∶1、3.5∶1、4∶1、4.5∶1、5∶1，研究壁芯比对胭脂萝卜硫素微胶囊成囊效果和包埋率的影响。

1.2.3.3 pH对胭脂萝卜硫素微胶囊包埋效果的影响 在壁材比例为4∶1,壁芯比为5∶1,OP-10添加量为0.5%,乳化时间为30 min,搅拌速度为300 r/min的条件下,改变pH为4.8、5.0、5.2、5.4、5.6,研究pH对胭脂萝卜硫素微胶囊成囊效果和包埋率的影响。

1.2.3.4 乳化剂添加量对胭脂萝卜硫素微胶囊包埋效果的影响 通过预实验,比较几种常用的乳化剂(SP20、SP80、OP-10)的乳化效果,发现添加OP-10乳化凝胶液的成囊效果最佳。在壁材比例为4∶1,壁芯比为5∶1,pH为5,乳化时间为30 min,搅拌速度为300 r/min的条件下,改变OP-10添加量为0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%,研究乳化剂添加量对胭脂萝卜硫素微胶囊成囊效果和包埋率的影响。

1.2.3.5 乳化时间对胭脂萝卜硫素微胶囊包埋效果的影响 在壁材比例为4∶1,壁芯比为5∶1,pH为5,OP-10添加量为0.5%,搅拌速度为300 r/min的条件下,改变乳化时间为10、20、30、40、50 min，研究乳化时间对胭脂萝卜硫素微胶囊成囊效果和包埋率的影响。

1.2.3.6 搅拌速度对胭脂萝卜硫素微胶囊包埋效果的影响 在壁材比例为4∶1,壁芯比为5∶1,pH为5,OP-10添加量为0.5%,乳化时间为30 min的条件下,改变搅拌速度为250、300、350、400、450 r/min，研究搅拌速度对胭脂萝卜硫素微胶囊成囊效果和包埋率的影响。

1.2.4 响应面试验 在单因素实验的基础上,固定壁芯比为4∶1,OP-10添加量为0.6%,选取对实验影响较大的因素(壁材比例、pH、搅拌速度,乳化时间)作为响应因子,以包埋率为响应值,采用Design Expert 8.0软件设计响应面实验,确定胭脂萝卜硫素微胶囊的最佳工艺条件。响应面设计的因素水平见表1。

表1 响应面实验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.5 微胶囊质量检测方法

1.2.5.1 粒径的测定 采用测微尺方法测定微胶囊的粒径[14]。

1.2.5.2 胭脂萝卜硫素微胶囊的表观形态 将制备的胭脂萝卜硫素微胶囊用导电胶固定在样品台上,喷金后,用扫描电镜进行观察。同时进行光学显微镜观察,放大倍数为10～40倍。

1.2.5.3 胭脂萝卜硫素微胶囊包埋率的测定 采用Wetter等[15]的方法测定萝卜硫素的含量。具体方法如下:精确量取萝卜硫素标样1.00 mg,再取9 mL超纯水于烧杯中,配成浓度为0.1 mg/mL的标准溶液。按照浓度梯度,配制浓度分别为0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03 mg/mL的标准溶液。浓度由低到高依次在201 nm处测定其吸光度,测3次,求平均值。然后以萝卜硫素测定的含量(mg/mL)为纵坐标,以所测得吸光度为横坐标,建立标准曲线。标准曲线方程为:Y=0.2304X-0.0506,决定系数R2=0.9995,根据标准曲线计算样品中萝卜硫素的含量。然后,按路宏波等[16]的方法略有修改,测定胭脂萝卜微胶囊的包埋率:

包埋率(%)=[1-(微胶囊表面萝卜硫素含量/加入的总萝卜硫素含量)]×100

1.2.5.4 微胶囊缓释性能的测定 以人工胃液和人工肠液为模拟体内环境作为释放介质,按龙海涛等[17]的方法,略有修改,测定微胶囊的缓释性能。具体操作如下:

准确称取4 g萝卜硫素微胶囊各20份,分别加入20 mL人工胃液(或人工肠液)于100 mL锥形瓶中。然后,将其置于恒温振荡器中,在37 ℃,转速为60 r/min,每隔30 min,取出1个锥形瓶,为排除部分微胶囊微粒的干扰,在转速为2000 r/min的条件下,离心10 min后取上清液测定其吸光度,计算出萝卜硫素的含量和释放率,从而考察其缓释性能。

1.3 数据处理

采用Design Expert 8.0软件设计响应面试验,采用Excel 2016版进行数据处理及绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 壁材比例对胭脂萝卜硫素微胶囊包埋效果的影响 结果如图1、图2所示。

图1 壁材比例对微胶囊形态和大小的影响Fig.1 The effect of the ratio of wall material on morphology and size of microcapsules注:(a)：3∶1;(b):4∶1;(c):5∶1;(d):6∶1;(e):7∶1。

图2 壁材比例对微胶囊包埋率和粒径的影响Fig.2 The effect of the ratio of wall material on embedding ratio and particle size of microcapsules

综合图1和图2可知,壁材比例为3∶1时,粘连严重,呈球不佳,这是由于淀粉含量增加后,由于淀粉黏度较仙草胶高,容易引起粘连,包埋率较低;壁材比例为4∶1时,微胶囊大小均匀,仅有少量微胶囊发生粘连,且微囊呈球性较好,包埋率最高,为68.73%±0.42%。这可能是由于仙草胶是一种弱凝胶的高黏度胶体,当加入适量的变性淀粉后,可以形成性能优良的凝胶[13],提高了萝卜硫素的包埋率;当壁材比例超过4∶1时,虽然微胶囊大小均匀,粘连较少,呈囊效果也较好,但包埋率逐渐降低,说明微胶囊有可能有一些空囊,这是由于仙草胶比例提高后,降低了壁材的凝胶效果,导致微胶囊的结构松散。所以选择壁材比为4∶1左右进行响应面优化实验。

2.1.2 壁芯比对胭脂萝卜硫素微胶囊包埋效果的影响 结果如图3、图4所示。

图3 壁芯比对微胶囊形态和大小的影响Fig.3 The effect of the ratio between wall material and core material on morphology and size of microcapsules注:(a):3∶1;(b):3.5∶1;(c):4∶1;(d):4.5∶1;(e):5∶1。

图4 壁芯比对微胶囊包埋率和粒径的影响Fig.4 The effect of the ratio between wall material and core material on embedding ratio and particle size of microcapsules

由图3、图4可知,当壁芯比低于4∶1时,虽然基本呈球型,无粘连现象,但是因芯材比例过高,壁材不能完全将芯材包裹,包埋率相对较低;当壁芯比增至为4∶1时,微胶囊成囊效果最好,且包埋率最高,为69.23%±0.51%;当壁芯比超过4∶1时,随着壁材比例的增加,包埋率逐渐降低,可能是由于壁材比例过高,使得微囊易聚集黏连,导致成囊效果变差,包埋率降低[18]。萝卜硫素为油溶性液体,自身具有一定的乳化性能,当萝卜硫素比例降低后,整个体系乳化效果降低,导致壁材与芯材之间融合较差,而出现粘连的现象。因此,选择壁芯比为4∶1。

2.1.3 pH对胭脂萝卜硫素微胶囊包埋效果的影响 结果如图5、图6所示。

图5 pH对微胶囊形态和大小的影响Fig.5 The effect of pH on morphology and size of microcapsules注:(a):4.8;(b):5.0;(c):5.2;(d):5.4;(e):5.6。

图6 pH对微胶囊包埋率和粒径的影响Fig.6 The effect of pH on embedding ratio and particle size of microcapsules

综合图5和图6可知,pH为5.0时,微胶囊粒径范围较窄,大小分布较均匀,平均粒径为(21±4) μm,形态规则,成囊效果好,包埋率最高。这说明在此pH下,有利于仙草胶与变性淀粉形成稳定凝胶的凝胶结构,使得萝卜硫素微囊的结构变得更加致密;当pH超过5.0时,微胶囊随pH的升高而发生形变,形状逐渐变得不规则,空壳结构开始增多,成囊效果逐渐变差,包埋率逐渐降低。其原因可能是仙草胶为酸性多糖,易溶于碱性溶液,较高的pH会使仙草胶的溶解性增加[19],而导致微胶囊的结构变得松散、甚至发生形变。当pH低于5.0时,因为溶液的pH过低,不利于仙草胶的溶解,会影响成囊的效果和包埋率。综上所述,选择pH5.0进行响应面优化实验。

2.1.4 OP-10添加量对胭脂萝卜硫素微胶囊包埋效果的影响 结果如图7、图8所示。

图7 OP-10添加量对微胶囊形态和大小的影响Fig.7 The effect of content of OP-10 on morphology and size of microcapsules注:(a):0.4%;(b):0.5%;(c):0.6%;(d):0.7%;(e):0.8%。

图8 OP-10添加量对微胶囊包埋率和粒径的影响Fig.8 The effect of content of OP-10 on embedding ratio and particle size of microcapsules

乳化剂可以降低微胶囊成囊液中的油-水界面张力,在油相液滴表面,乳化剂的吸附还能形成空间位阻效应,从而降低乳液中液滴的聚集速度,提高成囊液的稳定性[20]。由图7和图8可知,随着OP-10用量的增加,萝卜硫素微胶囊的成球性和分散效果越来越好,平均粒径从(108±9) μm减少至(20±5) μm,粒径变得越来越小。当OP-10添加量为0.6%时,乳化效果较佳,包埋率最高,为69.17%±0.46%。当OP-10添加量大于0.6%时,包埋率略有降低,这可能是随着乳化剂用量的增加，导致微囊粒径过小,不利于萝卜硫素微胶囊的回收,造成了微胶囊的损失所致。综述所述,选择OP-10添加量为0.6%。

2.1.5 乳化时间对胭脂萝卜硫素微胶囊包埋效果的影响 结果如图9、图10所示。

图9 乳化时间对微胶囊形态和大小的影响Fig.9 The effect of emulsifying time on morphology and size of microcapsules注:(a):10 min;(b):20 min;(c):30 min;

图10 乳化时间对微胶囊包埋率和粒径的影响Fig.10 The effect of emulsifying time on embedding ratio and particle size of microcapsules

由图9和图10可知,当乳化时间不超过40 min时,随着乳化时间的延长,乳化效果越来越好,微胶囊的粒径逐渐变小,包埋率逐渐增加。当乳化时间为40 min时,微胶囊包埋率最高，粒径分布范围较窄,粒径平均值为(20±4) μm,成囊效果较好,包埋率最高;当乳化时间超过40 min时,乳化充分成囊效果好,但微胶囊粒径较小,但包埋率却降低。可能原因是乳化时间过长会引起微胶囊粒径变小,不利回收,导致微胶囊的损失,包埋率降低。所以,选取乳化时间为40 min进行响应面优化实验。

2.1.6 搅拌速度对胭脂萝卜硫素微胶囊包埋效果的影响 结果如图11、图12所示。

图11 搅拌速度对微胶囊形态和大小的影响Fig.11 Analysis of stirring speed on morphology and size of microcapsules注:(a):250 r/min;(b):300 r/min;(c):350 r/min;

图12 搅拌速度对微胶囊包埋率和粒径的影响Fig.12 The effect of stirring speed on embedding ratio and particle size of microcapsules

综合图11和图12可知,搅拌速度为300 r/min时,乳化比较充分,微胶囊粒径分布均匀,粒径的平均值为(20±4) μm,成囊效果好,包埋率最高,为69.55%±0.39%。当搅拌速度高于300 r/min时,由于搅拌速率增大,乳化更充分,粒径变小,成囊效果变好,但搅拌速率过高会使油相与水相乳液的稳定性受到破坏,导致部分萝卜硫素没有完整被包覆,导致包埋率降低。而搅拌速率低于300 r/min时,乳化不充分，油相与水相乳液不能保持稳定均匀的分散,导致壁材没有很好地包覆芯材,且微胶囊粒径分布范围较宽,成囊效果不佳。故选择搅拌速度300 r/min进行响应面优化试验。

2.2 胭脂萝卜硫素微胶囊制备工艺优化

2.2.1 响应面试验 实验设计安排及结果见表2,方差分析见表3。因素间的交互作用见图13、图14。

表2 响应面实验设计与结果Table 2 Designs and results of response surface experiments

表3 响应面回归方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation of response surface experiments

图13 pH和壁材比例对微胶囊包埋率的影响Fig.13 Effects of pH and ratio of wall material on embedding ratio of microcapsules

图14 壁材比例和搅拌速度对微胶囊包埋率的影响 Fig.14 Effects of ratio of wall material and stirring time on embedding ratio of microcapsules

通过Design-Expert 8.0软件对表2进行分析,获得包埋率与pH、壁材比例、乳化时间、搅拌速度之间的回归二次方程:包埋率=70.71-0.46A+0.86B-0.42C+1.06D-0.77 AB-0.36AC-0.082AD-0.64BC-0.77BD+0.43CD-2.55A2-2.71B2-0.32C2-1.59D2。在p=0.05的水平下除去不显著项,得到的回归方程为:包埋率=70.71-0.46A+0.86B-0.42C+1.06D-0.77AB-0.77BD-2.55A2-2.71B2-1.59D2。

由表3可知,模型显著性检验p<0.0001,故该模型极显著。失拟项p值为0.0891>0.05不显著,说明本实验回归方程误差小、拟合程度好。决定系数为R2=0.9515,说明响应值的变化有95.15%来源于所选的变量,因此包埋率具较好的拟合度。综上所述，该模型与实际情况拟合度较好,可用于预测胭脂萝卜硫素微胶囊包埋率的变化情况。

比较F和p值大小可知,A、B、C、D对胭脂萝卜硫素微胶囊包埋率的影响顺序为D>B>A>C,即:搅拌速度>壁材比例>pH>乳化时间,其中搅拌速度和壁材比例对包埋率的影响极显著(p<0.001),pH和乳化时间也对包埋率影响显著(p<0.05);A2、B2、D2对微胶囊包埋率的影响极显著(p<0.001)，AB、BD影响显著(p<0.05)。由图13可知,壁材比例上升的幅度较之pH稍陡,说明壁材比例对微胶囊包埋率的影响较pH大，且其交互作用对包埋率的影响显著。由图14可知,剪切速率上升的幅度较之壁材比例稍陡,说明剪切速率对微胶囊包埋率的影响较壁材比例大，且其交互作用对包埋率的影响显著。这与方差分析结果一致。

2.2.2 胭脂萝卜硫素微胶囊最优工艺条件的确定 根Design-Expert 8.0软件分析得到的最佳工艺参数为:pH为4.98,壁材比例为4.23∶1(仙草胶∶变性淀粉),乳化时间为32.75 min,搅拌速度为309.17 r/min,在此工艺条件下微胶囊理论包埋率为71.07%。根据实验条件改进工艺参数为:pH为5,壁材比例为4∶1(仙草胶∶变性淀粉),乳化时间为33 min,搅拌速度为310 r/min。固定壁芯比为4∶1,OP-10添加量为0.6%,按此工艺进行3次平行实验,求得平均包埋率为70.63%±0.49%,其相对误差为0.62%,与预测值差异不大,由此可以推断该模型是可靠的。

2.3 微胶囊的大小及表面形态测定结果

萝卜硫素微胶囊的微观形态见图15和图16。

图15 萝卜硫素微胶囊在光学显微镜下的形态Fig.15 Morphology of sulforaphane microcapsules under optical microscope

图16 萝卜硫素微胶囊电镜扫描图Fig.16 SEM of sulforaphane microcapsules

按2.2.2中最优条件制备胭脂萝卜硫素微胶囊,通过测微尺测得微胶囊的平均粒径为(20±5) μm。光学显微镜下观察发现:制备的胭脂萝卜硫素微胶囊基本无粘连,形状较规则。在扫描电子显微镜下观察发现:制备的胭脂萝卜硫素微胶囊表面光滑,大部分呈球形,分布较均匀,成囊效果好。

2.4 微胶囊产品缓释性能分析

根据吸光度计算缓释过程中的萝卜硫素含量,绘制微胶囊产品的缓释曲线,结果如图17所示。

图17 萝卜硫素微胶囊的缓释规律Fig.17 Sustained-release rule of sulforaphane microcapsules

由图17可知,萝卜硫素微胶囊在肠液中的释放率明显高于在胃液中的释放率。在人工肠液中,萝卜硫素的释放速率呈现先快后缓的趋势;而在人工胃液中,其释放速率呈先缓后快的趋势。当时间为150 min时,人工肠液中的萝卜硫素释放率超过了50%,而人工胃液中萝卜硫素释放率不到20%。说明微胶囊对萝卜硫素具有一定的保护作用,萝卜硫素微胶囊在体外释放主要发生于肠道中。其原因可能是仙草胶为酸性凝胶,易溶于碱性溶液,肠液为中偏碱性的环境,会导致微胶囊结构疏松,另外,胰蛋白酶作用于明胶,将明胶中的碱性氨基酸的羧基段肽键剪切,然后作用于糊精及酯化淀粉上,造成了壁材的破裂[17],导致萝卜硫素释放出来。

3 结论

本文以仙草胶-变性淀粉为壁材,通过乳化-凝胶法制得了胭脂萝卜硫素微胶囊。通过单因素实验和响应面试验,优选出制备胭脂萝卜微胶囊的最佳工艺:壁芯比为4∶1,OP-10添加量为0.6%,pH为5,壁材比例4∶1(仙草胶∶变性淀粉),乳化时间33 min,搅拌速度310 r/min。在此条件下制备的微胶囊表面光滑,成球性较好,粒径分别范围较窄,平均粒径为(20±5) μm,包埋率高达70.63%±0.49%。体外释放实验表明,制备的萝卜硫素微胶囊具有良好的肠溶性。通过微胶囊化不仅提高了胭脂萝卜硫素的稳定性,还有利于实现萝卜硫素的缓释、控释,从而拓宽胭脂萝卜硫素的使用范围。