中药益肾平肝方对脱髓鞘模型小鼠社会交互行为的影响及作用靶点

吴 燕 孙作厘 马 超 朱 虹 尹冬青 贾竑晓

(首都医科大学附属北京安定医院 国家精神心理疾病临床医学研究中心 精神疾病诊断与治疗北京市重点实验室，北京 100088)

精神分裂症是一种病因尚未完全阐明的复杂性的精神疾病，全球人口受累率达到0.5%～1.0%[1]，是导致残疾的十种主要疾病之一，给家庭和社会带来巨大的经济负担[2]。精神分裂症发病有多种假说，包括多巴胺D2受体亢进假说及神经发育异常假说[3]。目前抗精神病药物主要是基于多巴胺D2受体作为靶点发挥临床治疗效果，但是仍然有一部分患者无法临床痊愈，因此从神经保护角度开发新的抗精神病药物是精神药物研究的重要方向之一[4]。

益肾平肝方(Yishenpingganfang,YSPGF)[5]是首都医科大学附属北京安定医院中西医结合团队用于治疗精神分裂症前驱期的一个有效经验方，其临床研究结果表明，该中药方剂对精神分裂症前驱期的症状和认知损害有改善作用。它的主要成分有菊花、山茱萸、防风、何首乌等。从山茱萸[6]和何首乌[7]中提取的活性成分对神经有保护作用。cuprizone模型[8](CPZ模型)是基于神经发育假说的一种能够诱导中枢神经系统少突胶质细胞丢失和脱髓鞘的精神分裂症样模型[9]。为此，本研究采用CPZ模型研究中药益肾平肝方的药理学作用机制[10]。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6周龄的雄性C57BL/6小鼠，共30只，体质量(20±2)g。所有小鼠均由首都医科大学实验动物部提供，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0011。实验环境清洁，昼夜交替12 h，正常饮食饲养1周以适应环境。本实验通过首都医科大学动物伦理委员会批准(伦理批号：AEEI-2018-047)。

1.2 主要药品及试剂

双环己酮草酰二腙(cuprizone,CPZ)和成熟少突胶质细胞特异性抗体髓鞘碱性蛋白抗体 (Anti-Myelin Basic Protein，MBP抗体)购自美国 Sigma公司；少突胶质细胞前体细胞血小板源生长因子受体α(platelet-derived growth factor receptor-alpha, PDGFR-α)抗体(PDGFR-α抗体，APA5)购自美国Abcam公司。YSPGF的各种单药饮片购自北京同仁堂(大栅栏店)，在首都医科大学宣武医院熬制成浸膏。兔二步法检测试剂盒和DAB显示试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 主要仪器

社会交互实验系统(40 cm × 60 cm ×20 cm，由3个连在一起的箱子构成，厢壁由透明有机玻璃制成)购自上海欣软信息科技有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组及处理

适应1周后，将小鼠采用数字表法随机分为3组，每组10只：对照组，CPZ模型组[CPZ+0.9%(质量分数)氯化钠注射液]，YSPGF组(CPZ+YSPGF，YSPGF的给药剂量3.54 g·kg-1·d-1)。对照组正常饮食，模型组和YSPGF组食用混合了0.2 %(质量分数)CPZ的特殊饲料，每日给予。建模4周后，模型组以0.9%(质量分数)氯化钠注射灌胃2周，YSPGF组给予中药YSPGF(3.54 g·kg-1·d-1)灌胃2周。每周测量1次小鼠体质量。

1.4.2 社会交互实验

用来评定小鼠社会交往能力和对新事物的探索能力。提前将小鼠搬入测试室，使小鼠适应实验装置5 min，每天1次，连续3 d。试验当天，在试验1(Trial 1)中，被试小鼠被放置在中间的箱子中，并被允许在3个箱室中探索10 min。一只陌生的老鼠被关在铁丝笼子里，被放在一边的箱子里，另一边的箱子里放着一个空笼子。在试验2(Trial 2)中，一只新的不熟悉的老鼠被放在之前放空笼子的箱子里中。记录时间均为10 min。 每次实验结束用稀释的乙醇彻底清洁箱笼。实验中所需的两只陌生小鼠需要与待测的小鼠品系、年龄、性别以及体质量相匹配，并且该小鼠与待测小鼠不能同笼饲养过。整个实验过程中，需使用相同的两只陌生小鼠。测试过程采用视频记录仪(上海欣软信息科技有限公司)记录并分析。

1.4.3 固定标本与取材

在完成行为学测试后，5只小鼠经4%(质量分数)水合氯醛腹腔麻醉，然后进行心脏灌注，先灌注30 mL 0.9%(质量分数)的氯化钠注射液至肺脏和肝脏的颜色变为灰白，接着灌注50 mL 4%(质量分数)多聚甲醛溶液，待小鼠四肢抽搐结束，僵硬即可。取出小鼠大脑，用4%(质量分数)多聚甲醛溶液固定，用于免疫组化染色研究。使用兔二步法和DAB染色法进行染色。5只小鼠经颈部脱臼处死，迅速取出大脑移至-80 ℃保存，用于Western blotting分析。

1.5 统计学方法

数据分析采用Graph Pad软件(Prism 5版本)。对3组小鼠在社会互动实验中与陌生鼠的接触时间(s)进行t检验，以P<0. 05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 YSPGF对小鼠体质量及小鼠胼胝体髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)表达的影响

前2周，3组小鼠体质量变化差异无统计学意义。但从第3周开始，模型组小鼠体质量明显减低(P<0.05)。第4周体质量略微增加。模型组小鼠体质量变化与YSPGF组小鼠相比，差异无统计学意义(P>0.05)(图1A)。 免疫组化分析结果(图1B)显示，模型组小鼠胼胝体MBP表达明显下降,说明本研究CPZ模型的建立是成功的。给予YSPGF处理后该组小鼠MBP表达有一定提高，提示YSPGF对白质损伤具有保护作用。

2.2 YSPGF对CPZ小鼠社会交互的影响

Trial 1 实验中：对照组小鼠围绕陌生小鼠1 (Stranger 1)的时间明显大于围绕空杯子(Empty)的时间(P<0.001)。YSPGF组与对照组类似，围绕Stranger 1与Empty的时间差异有统计学意义(P<0.01)。但模型组小鼠围绕Stranger 1与Empty的时间之间差异无统计学意义(P>0.05)(图2A)。

Trial 2实验中：对照组小鼠对新加入的Stranger 2较之已经熟悉的Stranger 1更加感兴趣(P<0.001)，与对照组不同，模型组小鼠并没有对Stranger 2表现出好奇，表明其社会动力以及对新奇事物的探索能力下降；YSPGF组小鼠与新的陌生小鼠接触时间与模型组相比，明显增多，表明YSPGF对CPZ小鼠的社会交往能力以及对新生事物的探索能力均有改善(图2B)。

2.3 YSPGF对小鼠海马PDGFR-α表达的影响

Western blotting 结果(图3)显示，PDGFR-α经CPZ诱导脱髓鞘后有反应性增生，给予YSPGF进行干预后，PDGFR-α的代偿性增生与模型组相比，呈减少趋势，表明YSPGF对小鼠的少突胶质细胞损害有所改善。

图1 YSPGF对小鼠体质量及小鼠胼胝体MBP表达的影响 Fig.1 Effects of YSPGF on body weight and MBP expression in callosum in cuprizone-induced model mice

A：weight changes in different groups,n=10;B： effects of YSPGF on MBP staining in callosum(n=5)(immunohistochemistry staining, 40×)；YSPGF:Yishenpingganfang；MBP：myelin basic protein.

图2 YSPGF对CPZ小鼠社会交互的影响Fig.2 Effects of YSPGF on social behavior in cuprizone-induced model miceA：Trial 1; B:Trial 2; n=10. **P<0.01, ***P<0.001; YSPGF：Yishenpingganfang; CPZ:cuprizone.

图3 YSPGF对海马PDGFR-α表达的影响Fig.3 Effects of YSPGF on PDGFR-α expression in hippocampus in cuprizone-induced model mice

n=5,*P<0.05，**P<0.01.PDGFR-α:platelet-derived growth factor receptor-alpha;YSPGF：Yishenpingganfang.

3 讨论

越来越多的证据[11-13]显示，精神分裂症中少突胶质细胞/髓鞘存在异常，其证据主要来源于影像学研究[11]、尸检[12]以及基因学研究[13]。CPZ[14]是一种铜离子的螯合剂，第一次对CPZ的描述可追溯到1950年Gustav Nilsson的实验[15-16]。研究[17]显示：CPZ选择性损伤少突胶质细胞。给予不同时间的CPZ处理会诱导出不同的行为学改变。例如，给予小鼠2～3周CPZ处理，小鼠会出现更多的攀爬行为，如果给予4～6周CPZ，则表现为社会功能退缩。本实验中，在给予小鼠4周CPZ后，免疫组化结果显示，CPZ小鼠在4周后少突胶质细胞大面积凋亡，说明笔者的CPZ小鼠模型是成功的。

在本实验中，笔者采用CPZ诱导精神分裂症样动物行为，采用中药YSPGF对CPZ小鼠进行治疗。本研究社会交互实验结果显示；第一轮实验(Trial 1)中，对照组小鼠围绕陌生小鼠1 (Stranger 1)的时间明显大于围绕空杯子(Empty)的时间，YSPGF组与对照组类似，围绕Stranger 1与Empty的时间差异有统计学意义，但模型组小鼠围绕Stranger 1与Empty的时间之间差异无统计学意义，第二轮实验 (Trial 2) 中，对照组小鼠对新加入的Stranger 2较之已经熟悉的Stranger 1更加感兴趣，与对照组不同，模型组小鼠并没有对Stranger 2表现出好奇，表明其社会动力以及对新奇事物的探索能力下降；YSPGF组社会互动行为较模型组有一定的改善；社会交互实验主要反映实验动物的社会交往能力和对新事物的探索能力，在一定程度上模拟了精神分裂症的阴性症状(意志行为活动缺乏和情感平淡)，实验结果表明，给予YSPGF进行干预，CPZ小鼠的社会交往能力和探索能力有所改善，提示YSPGF对精神分裂症的阴性症状有一定的改善作用。

本研究免疫组化结果显示，模型组小鼠胼胝体MBP表达明显下降，Western blotting结果显示，少突胶质细胞前体细胞 PDGFR-α在CPZ诱导脱髓鞘后有反应性增生，说明经CPZ处理后小鼠少突胶质细胞/髓鞘有一定程度的受损。而经YSPGF干预后，MBP表达增多和PDGFR-α减少，说明中药方剂对少突胶质细胞/髓鞘的受损有一定改善作用，也提示了该处方有一定神经保护作用，也部分解释了YSPGF改善CPZ小鼠社会交互受损的药理学机制。

YSPGF中的山茱萸、何首乌含有神经保护作用的成分。多项研究[18-19]表明山茱萸中的山茱萸环烯醚萜苷[6](cornel iridoid glycoside，CIG)能改善局灶性脑缺血大鼠模型的神经功能缺损，抑制脑组织炎性反应和神经元凋亡，促进神经发生和血管新生；并且可改善穹窿-海马伞切断模型大鼠学习记忆功能，增高脑组织神经营养因子含量和神经元存活[20]。何首乌中提取的主要活性成分——四羟芪葡萄糖苷(tetrahydroxystilbene glucoside,TSG)具有明显的神经保护作用，可以改善动物的记忆能力。这些研究结果间接支持了本研究所发现的YSPGF的神经保护作用。

本研究只是用社会交互行为模型探讨了YSPGF对精神分裂症的阴性症状的改善作用，今后应该增加其他行为模型观察该方对精神分裂症的多维治疗效果，如用Y迷宫观察该方对CPZ小鼠的工作记忆受损是否有改善作用，用PPI观察该方对CPZ小鼠的感觉门控受损是否有改善作用。本研究只是从MBP和PDGFR-α的表达探讨了YSPGF的神经保护机制，今后应该从NRG1-ErBb4信号通路以及氧化应激通路更进一步探讨该方的神经保护作用。本研究只是用小样本动物进行了单一行为学实验，今后应该根据行为学的增多和作用机制的深度探讨扩大样本量。