孕激素受体膜组分1促进雌孕激素诱导的乳腺癌细胞增生的研究——雌二醇与周期序贯及连续联合比较

李 雪 阮祥燕，2* 谷牧青 蔡桂举 赵 越 Alfred O. Mueck,2

(1.首都医科大学附属北京妇产医院内分泌科，北京 100026；2.德国图宾根大学妇产医院妇女健康部与妇女健康研究中心, 图宾根 D-72076, 德国 )

中国女性的预期寿命为76.2岁[1]，而平均绝经年龄为49岁左右[2]，因此大部分女性一生中有超过1/3的时间在绝经后度过。绝经虽然是一种自然现象但会引起很多病理性结果，严重影响女性的生活质量(如潮热、出汗、失眠、抑郁、性交疼痛)，增加各种慢性病的发生(心血管病、骨质疏松、老年痴呆、萎缩性阴道炎、尿道炎等)[3-6]。

绝经后激素治疗(menopause hormone therapy, MHT) 是缓解绝经相关症状，预防或减少各种慢性病发生最有效的方法。 根据最新的中国绝经管理与绝经激素治疗指南 (2018)[7]，MHT 应该使用个体化的方案，对于有完整子宫，绝经过渡期或绝经后仍希望有月经样出血的妇女，应采用雌孕激素序贯方案，对于有完整子宫，绝经后不希望有月经样出血的妇女则提倡采用连续联合方案。

尽管MHT治疗可以缓解更年期症状，但是用药后乳腺癌风险增加仍然是降低MHT普及率的主要原因。如果能够找出激素致乳腺癌风险增加的原因与机制，采取精准预防及治疗对策，则可以充分发挥激素治疗的优势，避免或减少乳腺癌发生的风险。

乳腺癌发生风险增加可能不仅仅与肥胖、吸烟史、缺乏运动、酗酒有关，而且可能与某些特定的膜受体的表达相关。孕激素受体膜组分1 (progesterone receptor membrane component 1, PGRMC1)是近年发现的22 000～26 000的小蛋白，是多蛋白孕酮复合物的成员之一。目前的研究[8-11]提示PGRMC1促进癌症的进展，PGRMC1的表达在肺、甲状腺、结肠、卵巢、宫颈和乳腺癌中上调。本课题组的临床研究[12-13]表明，乳腺癌组织中不仅有PGRMC1高表达，同时PGRMC1表达水平与患者淋巴结转移、肿瘤大小、TNM 分级、总体生存率、无瘤生存率之间相关。前期的PGRMC1相关基础研究[14-15]主要使用MCF-7乳腺癌细胞系，但最近的研究[16]表明，与MCF-7乳腺癌细胞系相比，T47D细胞系是阐明乳腺癌与孕激素特异性作用的最理想的细胞模型。因此，本研究首次使用T47D细胞系探讨PGRMC1在激素与乳腺癌发病机制中的作用， 并对周期序贯/连续联合方案对乳腺癌细胞增生的作用进行比较， 以期找出激素致乳腺癌风险增加的原因, 为临床MHT治疗方案的选择提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

雌二醇(estradiol，E2), 屈螺酮(drospirenone，DRSP), 炔诺酮(norethisterone，NET)购自美国Sigma公司，使用乙醇稀释至10-2mol/L，并分装于100 μL EP管中；96孔板购自美国Corning公司；DMEM培养基和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自美国Hermo公司；青霉素购自美国Thermo公司；细胞培养箱购自美国Thermofisher公司；生物安全柜购自Haier公司。

1.2 细胞培养

从美国标准培养库购买 T47D 乳腺癌细胞系, 将细胞培养于含10%(体积分数)热灭活FBS、25 mmol/L HEPES以及1%(质量分数)青霉素的RPMI-1640 培养液中。37 ℃，5%(体积分数)CO2条件下细胞培养箱中进行培养。

1.3 T47D细胞转染

T47D细胞转染含有HA标记的PGRMC1(T47D-HA-PGRMC1)或空质粒(T47D-HA-vector), 质粒载体pcDNA3.0为5.3 kb，48 h后，用800 μg/mL 的G418 进行为期3周的单克隆筛选。为避免转染试剂的影响，将T47D-HA-vector设置为对照组。最后，Western blotting法检测T47D-HA-PGRMC1及T47D-HA-vector 的PGRMC1表达情况。

1.4 细胞增生实验

细胞培养接种: 细胞按照每孔4 000个[200 μL培养基RPMI 1640+10%(体积分数)FBS+1%(质量分数)青霉素]接种到96孔板，置于37 ℃培养箱，5%(体积分数)CO2条件下培养过夜，以使细胞贴壁。

细胞处理：使用无酚红的细胞培养液将激素稀释成目标浓度后，对细胞进行不同方案刺激。周期序贯方案：E2 10-12mol/L 或 10-10mol/L浓度处理3 d后加用100 nmol/L 孕激素(DRSP或NET)继续刺激3 d。连续联合方案：10-12mol/L 或 10-10mol/L 浓度的E2以及100 nmol/L 的孕激素(DRSP或NET)共同处理6 d。将T47D乳腺癌细胞系采用不同激素刺激方案处理后，使用CCK-8 进行细胞增生实验。具体检测方法为： 每孔加入20 μL CCK-8试剂，避光37 ℃ 培养箱孵育1 h。在M2机器上读取 D450波长的吸光度值。

1.5 统计学方法

数据采用SPSS17.0软件进行统计学分析。每组激素刺激方案组内设置3个重复，并重复实验3次，采用析因设计的方差分析比较E2浓度、细胞类型、DRSP和NET方案之间的差异有无统计学意义，以及E2浓度、细胞类型、DRSP和NET方案之间的交互作用，两两比较采用LSD方法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 构建稳定转染的T47D-HA-PGRMC1 细胞系

T47D细胞转染含有HA标记的PGRMC1，并用G418筛选3周，筛选出稳定表达的单克隆细胞株，用Western blotting法对转染/未转染 PGRMC1 的T47D细胞PGRMC1表达情况进行蛋白的测定。在T47D-HA-vector 细胞系中，未检测到PGRMC1的表达。 而T47D-HA-PGRMC1细胞则出现明显的PGRMC1表达条带，表明稳定表达PGRMC1的T47D-HA-PGRMC1 细胞系构建成功(图 1)。

图1 构建稳定转染的T47D-HA-PGRMC1 细胞系Fig.1 Stable overexpression of PGRMC1 in T47D-HA-PGRMC1

PGRMC1 was cloned in frame with HA in the T47D cells. After transfection, the expression was detected by Western blotting using rabbit anti-HA antibody and mouse anti-β-actin antibody. This figure showns representative Western blotting image of PGRMC1 expression in the T47D cells;PGRMC1:progesterone receptor membrane component 1.

2.2 单用雌激素对T47D乳腺癌细胞增生的影响

通过使用2×2析因方差分析，发现单用雌激素时，E2浓度之间的差异有统计学意义(P<0.05)，不同细胞类型(T47D-HA-vector、T47D-HA-PGRMC1)之间差异有统计学意义(P<0.05)，E2浓度和细胞类型之间没有交互作用(P>0.05)，详见表1。

两两比较结果显示，当E2浓度为0.001 nmol/L时，T47D-HA-vector(11%) 和 T47D-HA-PGRMC1(20%)均未出现显著的细胞增生(P>0.05)；当E2浓度为0.01 nmol/L时，T47D-HA-vector(11%) 和 T47D-HA-PGRMC1(21%)也未出现显著的细胞增生(P>0.05)；当E2浓度为0.1 nmol/L时，T47D-HA-vector的细胞增生约21%(P>0.05)，而T47D-HA-PGRMC1出现显著细胞增生56%(P<0.05)差异有统计学意义，详见图2。

E2/(nmol·L-1)TypeT47D-HA-vectorT47D-HA-PGRMC1FE2FtypeFinteract0.001110.57±22.02119.45±18.174.56∗6.65∗1.670.01113.34±19.17122.22±19.590.1120.57±28.52156.13±13.62 ∗ P<0.05, E2: estradiol;PGRMC1:progesterone receptor membrane component 1.

图2 单用雌激素对T47D乳腺癌细胞增生的影响 Fig.2 Effect of estrogen alone on cell proliferation of T47D breast cancer

T47D-vector cells and T47D-PGRMC1 cells were incubated with estradiol (E2: 0.001,0.01,0.1 nmol/L) alone cell proliferation was measured after 6 days. Data were presented as percentage of unstimulated control cells.*P<0.05vsunstimulated control；#P<0.05vscell proliferation of T47D-vector cells with the same treatment;E2: estradiol;PGRMC1:progesterone receptor membrane component 1.

2.3 周期序贯方案对T47D乳腺癌细胞增生的影响

通过使用2×2析因方差分析，发现对于T47D-HA-vector细胞，E2浓度之间的差异无统计学意义(P>0.05)，DRSP和NET方案之间的差异无统计学意义(P>0.05)，E2浓度、DRSP和NET方案之间没有交互作用(P>0.05)。对于T47D-HA-PGRMC1细胞，E2浓度之间的差异有统计学意义(P<0.05)，DRSP和NET方案之间的差异有统计学意义(P<0.05)，E2浓度、DRSP和NET方案之间没有交互作用(P>0.05),详见表2。

两两比较结果显示当E2浓度为0.001 nmol/L时，E2/DRSP(17%)和 E2/NET(18%)方案对T47D-HA-vector 细胞增生没有显著促进作用(P>0.05)，对于T47D-HA-PGRMC1细胞，E2/DRSP(27%)方案刺激后未出现显著增生(P>0.05)，而 E2/NET(82%)显著增加了该细胞的增生(P<0.05)。 与T47D-HA-vector 相比， E2/NET 方案显著增加了T47D-HA-PGRMC1细胞的增生(P<0.05)，详见图3。

当E2浓度为0.1 nmol/L 时，E2/DRSP(21%)对T47D-HA-vector 细胞增生没有显著促进作用(P>0.05)，而E2/NET(37%)显著增加了细胞增生(P<0.05)，对于T47D-HA-PGRMC1细胞，各不同处理组均表现出明显的增生(P<0.05),其增生情况依次为E2/DRSP(105%), E2/NET(170%)。与T47D-HA-vector 相比，E2/DRSP和E2/NET 方案均显著增加了T47D-HA-PGRMC1细胞的增生(P<0.05)，详见图3。

2.4 连续联合方案对T47D乳腺癌细胞增生的影响

通过使用2×2析因方差分析，发现对于T47D-HA-vector细胞，E2浓度之间的差异有统计学意义(P<0.05)，DRSP和NET方案之间的差异无统计学意义(P>0.05)，E2浓度、DRSP和NET方案之间没有交互作用(P>0.05)。对于T47D-HA-PGRMC1细胞，E2浓度之间的差异有统计学意义(P<0.05)，DRSP和NET方案之间的差异有统计学意义(P<0.05)，E2浓度、DRSP和NET方案之间不存在交互作用(P>0.05)，详见表3。

E2/(nmol·L-1)T47D-HA-vectorDRSPNETT47D-HA-PGRMC1DRSPNET0.001116.87±15.50118.50±12.44127.20±26.69181.66±5.280.1121.11±13.36137.00±7.04204.88±20.27269.91±2.86FE22.48771.24∗FDRSP1.47436.96∗Finteract0.9810.289 ∗P<0.05;PGRMC1:progesterone receptor membrane component 1; E2: estradiol; DRSP: drospirenone; NET: norethisterone.

图3 周期序贯方案对T47D乳腺癌细胞增生的影响 Fig.3 Proliferation effect of sequential combination on T47D cells

T47D-vector cells and T47D-PGRMC1 cells were incubated with estradiol (E2: 10-12or 10-10mol/L) in sequential combination with drospirenone (DRSP), and norethisterone (NET) (10-7mol/L). Cell proliferation was measured after 6 days. Data were presented as percentage of unstimulated control cells.*P<0.05vsunstimulated control;#P<0.05vscell proliferation of T47D-vector cells with the same treatment.E2: estradiol;DRSP: drospirenone;NET: norethisterone；PGRMC1:progesterone receptor membrane component 1.

两两比较结果显示当E2浓度为0.001 nmol/L时，E2/DRSP(17%)和 E2/NET(22%)方案对T47D-HA-vector 细胞增生没有显著促进作用(P>0.05)，而E2/DRSP(77%) 和 E2/NET(158%)方案均显著增加了T47D-HA-PGRMC1的细胞增生(P<0.05)。与T47D-HA-vector 相比，E2/DRSP和E2/NET 方案均显著增加了T47D-HA-PGRMC1细胞的增生(P<0.05)，详见图4。

当E2浓度为0.1 nmol/L 时E2/DRSP(31%)对T47D-HA-vector 细胞增生没有显著促进作用(P>0.05)，而E2/NET(44%)显著增加该细胞的增生(P<0.05)，对于T47D-HA-PGRMC1细胞，各不同处理组均表现出明显的增生(P<0.05),其增生情况依次为E2/DRSP(129%), E2/NET(174%)。 与T47D-HA-vector 相比，E2/DRSP和E2/NET 方案均显著增加了T47D-HA-PGRMC1细胞的增生(P<0.05)，详见图4。

图4 连续联合方案对T47D乳腺癌细胞增生的影响 Fig.4 Proliferation effect of continuous combination on T47D cells

T47D-vector cells and T47D-PGRMC1 cells were incubated with estradiol (E2： 10-12or 10-10mol/L) in continuous combination with drospirenone (DRSP) and norethisterone (NET) (10-7mol/L). Cell proliferation was measured after 6 days. Data were presented as percentage of to unstimulated control cells.*P<0.05vsunstimulated control;#P<0.05vscell proliferation of T47D-vector cells with the same treatment；E2: estradiol;DRSP: drospirenone;NET: norethisterone；PGRMC1:progesterone receptor membrane component 1.

3 讨论

本实验的研究结果表明，在T47D-HA-PGRMC1 细胞系中雌激素的作用是剂量依赖性的。当雌激素浓度为0.1 nmol/L时，单用雌激素就能使T47D-PGRMC1细胞系明显增生，所以对于过表达PGRMC1的乳腺癌患者，建议选择低剂量的经皮或口服雌激素。然而，即使是在雌激素浓度较低的情况下(E2=0.001 nmol/L)，加用NET仍然可以观察到明显的对增生的促进作用。所以激素与乳腺癌增生的作用还与激素类型相关。

E2/(nmol·L-1)T47D-HA-vectorDRSPNETT47D-HA-vectorDRSPNET0.001116.89±8.20121.83±7.88177.12±7.37258.00±10.860.1131.11±17.31143.66±7.44228.62±12.67274.25±8.15FE28.053∗34.503∗FDRSP1.896120.32∗Finteract0.3580.864 ∗P<0.05 E2: estradiol; DRSP: drospirenone; NET: norethisterone.

使用周期序贯方案时，当雌激素浓度较低时(E2=0.001 nmol/L)，仅有E2/NET方案有明显的促增生作用，但是对于连续联合方案(E2=0.001 nmol/L)，E2/DRSP, E2/NET 均表现出明显的促增生作用，说明在雌激素剂量较低情况下，连续联合方案比周期序贯方案对乳腺癌细胞增生的刺激作用更明显。同样，当雌激素剂量增加到0.1 nmol/L 时，对于DRSP, 周期序贯方案 E2/DRSP(204.9%)与连续联合方案E2/DRSP(268.6%)相比，连续联合方案更能明显地促进细胞的增生。然而对于NET，周期序贯方案E2/NET(258.0%)与连续联合方案 E2/NET(270.0%)，对乳腺癌细胞系的促进增生作用无明显区别。

作为非特异性的膜相关孕激素受体，PGRMC1与孕激素存在中等或较强的亲和力[17-18]。除了细胞色素B5结构域，PGRMC1还有许多结构位点可以与蛋白相互作用，并与信号转导有关，包括一个SH3靶序列，两个SH2靶序列，一个酪氨酸激酶位点，两个嗜酸性激酶位点及类似细胞外调节蛋白激酶和3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1的结合中心。越来越多的证据表明PGRMC1促进癌症的进展。首先，PGRMC1 在多种肿瘤组织中表达上调[8-11]。其次，PGRMC1参与多种实体肿瘤的细胞功能，如PGRMC1能促进卵巢癌细胞的分裂[19]，同时也能促进肺癌细胞的增生及转移[20]。此外，与本研究结果一致，本课题组的动物实验结果[21]表明E2, 以及E2/NET 周期序贯方案刺激下，转染过表达PGRMC1的裸鼠异种移植瘤体积比转染空质粒的移植瘤增加2～3倍。

本研究选用T47D细胞系的主要原因是，其在激素与乳腺癌发生风险中的应用较少[22]。 而且，该细胞系最近被认为是乳腺癌研究的理想细胞系[16,23]。浓度选择方面，单用雌激素刺激时，本研究选取了0.1、0.01、0.001 nmol/L 3个E2 浓度, 是因为当 E2 每日剂量为2 mg 时，血液E2浓度可达 50～200 pg/mL，约相当于0.01～0.1 nmol/L，而雌激素在组织中的浓度约是其在血液中的十倍[24]。

体外实验不能代替临床试验，本课题组进行的体外实验仅为临床研究提供一个参考思路。另一个不足之处是仅选用了T47D 乳腺癌细胞系，但是T47D细胞系已经被证实为乳腺癌相关研究的理想细胞系，而且迄今为止，尚没有该细胞系周期序贯方案/连续联合方案比较的研究。

本课题组的研究表明，对过表达PGRMC1的乳腺癌患者应用连续联合方案比周期序贯方案更有可能促进乳腺癌细胞的增生，合成孕激素NET 的促进增生作用最明显。当雌激素应用剂量较低时，不同激素刺激方案对乳腺癌细胞的增生作用影响也较低，所以临床应用雌激素时应使用能够缓解更年期症状的最小雌激素剂量，以期达到最大临床效果的同时，使乳腺癌的风险达到最低。