响应面优化超声辅助提取胭脂果色素工艺研究

张言，高定烽，李思敏，熊华斌，2，3，*，高云涛，杨志

（1.云南民族大学化学与环境学院，云南昆明650500；2.云南省跨境民族地区生物质资源清洁利用国际联合研究中心，云南昆明650500；3.民族地区矿产资源综合利用重点实验室，云南昆明650500）

胭脂果又名鬼眼睛果、狗眼睛果等。胭脂果树木分布并不是非常广泛，主要生长在云南省的德宏州，8月生长最为茂盛，富含黄酮类、内酯、蛋白质、脂肪和微量矿物质，是补气血的佳果。此外含有大量胡萝卜素、黄酮和维生素C，可以增加人体的免疫力，滋润皮肤，具有延缓衰老、抗癌等作用。采摘后的新鲜水果，可以直接食用，也可以用盐和辣椒腌制，或者用白糖炖煮。它具有强化脾脏开胃的作用，对消化不良有很大帮助。

近几年国内对植物天然色素的提取[1-3]有很大的进展研究，但对胭脂果的研究鲜有报道，为了更好的、更科学的开发利用胭脂果资源，本试验以胭脂果为原材料，采用超声辅助提取胭脂果色素，通过单因素[4-5]和响应面试验[6-7]进行优化得到最佳提取条件，实现工业化生产，旨在为胭脂果色素的综合开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胭脂果果实采自于德宏盈江；95%乙醇、乙酸乙酯、乙二醇、石油醚（均为分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；试验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

SJIA-2012 超声波细胞破碎机、DC-2006 低温恒温槽：宁波双嘉仪器有限公司；8453 型紫外可见分光光度计：美国安捷伦公司；FA2004 电子分析天平：上海上平仪器公司；HH-6 双列六孔水浴锅：力辰科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色素最佳溶剂的选择及最大吸收峰的测定

称取2.0 g 胭脂果干燥果实7 份，放置于7 个50 mL烧杯内，分别加入50 mL 超纯水、30%乙醇、50%乙醇、95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、乙二醇，然后在室温下振荡萃取12 h，过滤，滤液做光谱扫描测定。

取2.0g 胭脂果干燥果实样本，按液固比10∶1（mL/g）加入上述最佳的提取溶剂，分置于50、60、70 ℃水浴中萃取2 h，以4 000 r/min 离心10 min，取上清液，备测。备测样品用对应溶剂稀释25 倍，再进行200 nm～700 nm 的光谱扫描，得到色素溶液的吸收光谱和最大吸收峰。

1.3.2 考察提取液固比

准确称取2.0 g 胭脂果干粉共6 份，分别置于6 个200 mL 烧杯中，以保鲜膜封口，按液固比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g）加入最佳的溶剂开展平行色素提取试验，每个平行组均置60 ℃水浴中浸提2 h，然后取滤液离心，稀释相同的倍数，备测。

1.3.3 考察超声功率

精确称取2.0 g 胭脂果胭脂果干粉共7 份，置于200 mL 烧杯中，以保鲜膜封口并置60 ℃水浴中浸提2 h，然后取出各烧杯，设置液固比为15∶1（mL/g），超声时间为40 min，分别以100、200、300、400、500、600、700 W 进行超声辅助提取，然后取滤液离心，稀释相同的倍数，备测。

1.3.4 考察超声时间

准确称取7 份2.0 g 胭脂果干粉，置于200 mL 烧杯中，将瓶口以保鲜膜封口并置60 ℃水浴中浸提2 h，然后取出各烧杯，设置液固比为15∶1（mL/g），超声功率为500W，分别超声辅助提取10、20、30、40、50、60min，然后取滤液离心，稀释相同的倍数，备测。

1.3.5 色素超声辅助提取的响应面法优化

选取色素提取试验中的液固比、超声功率和超声时间3 个因素为自变量，以提取色素的吸光度值为响应值，采用Design Expert 软件进行试验设计[8]，然后根据所得设计结果进行试验，最终采用所得试验结果进行响应面分析，获取所需试验数据。

2 结果与分析

2.1 色素最佳溶剂的选择及最大吸收峰的测定

不同种类溶剂对胭脂果果实色素的溶解性见表1。

表1 不同种类溶剂对胭脂果果实色素的溶解性Table 1 Solubility of different kinds of solvent to pigment of carmine fruit

由表1可知，在胭脂果色素振荡萃取的试验中，对比7 种溶剂，50%乙醇是色素溶出的最佳的溶剂，故均用50%乙醇作为溶剂进行以下试验。

50、60 ℃和70 ℃水浴萃取的上层清液在200 nm～700 nm 范围光谱吸收图见图1。

如图1所示三者都有相似的光谱图，都显示277 nm是色素溶液的最大光吸收波长。并在277 nm 波长处的吸光度分别是：0.614、0.831 和0.824。说明60 ℃是50%乙醇萃取胭脂果色素的最佳温度，50 ℃时吸光度是最低的，70 ℃时吸光度略低于60 ℃，但是由于乙醇的沸点为78.15℃，所以在70 ℃下已经接近挥发，损耗太大[9]，所以为了后续试验故使用60 ℃作为提取温度。

图1 胭脂果果实色素溶液的吸收光谱Fig.1 Absorption spectrum of pigment solution of carmine fruit

2.2 液固比对色素提取的影响

不同液固比条件下提取的胭脂果色素溶液的吸光度见图2。

图2 不同液固比条件下提取的胭脂果色素溶液的吸光度Fig.2 Absorbance of carmine fruit pigment solution extracted under different liquid ratios

由图2可知，在液固比5∶1（mL/g）～30∶1（mL/g），提取率随液固比增大呈上升趋势，液固比增加到15∶1（mL/g）时，色素提取的吸光度达到最大，液固比大于15∶1（mL/g）时，色素提取的吸光度随着液固比增加而缓慢减少，这是由于随着胭脂果干粉质量增加，溶解的色素也在增加，但是乙醇体积有限，溶解能力有限，无法将胭脂果干粉全部溶解，故色素提取的吸光度值反而降低，因此出现提取吸光度随着液固比增加，而提取率下降的现象。所以本试验选择了液固比为15∶1（mL/g）。

2.3 超声功率对色素提取的影响

不同超声功率条件下提取的胭脂果色素溶液的吸光度见图3。

图3 不同超声功率条件下提取的胭脂果色素溶液的吸光度Fig.3 Absorbance of carmine fruit pigment solution extracted under different ultrasonic power

由图3可知，超声输出100 W 到200 W 时吸光度几乎没有变化。但从200 W 开始，随着输出功率的增加，色素的吸光度也开始开始增加，至超声功率为500 W 时，色素的吸光度值达到了最大为0.874；继续增大超声功率，提取果实色素的溶液吸光度反而下降。对胭脂果果实色素提取的这种影响，可能是由于超声功率过高，超声波对胭脂果的组织结构产生了破坏作用[10-11]，体系中有微小的淀粉颗粒析出并吸附了部分色素分子，这一部分色素在离心过程中被沉淀，从而造成提取液的吸光度降低[12]。所以本试验选择了超声功率为500 W。

2.4 超声时间对色素提取的影响

不同超声时间条件下提取的胭脂果色素溶液的吸光度见图4。

图4 不同超声时间条件下提取的胭脂果色素溶液的吸光度Fig.4 Absorbance of carmine fruit pigment solution extracted under different ultrasonic time conditions

由图4可以看出，在0 min～20 min 时，随着超声时间的延长，提取液的吸光度值呈直线上升趋势；与0min～20 min 时相比，随着超声时间的延长，20 min～50 min时提取液的吸光度值较平缓，这可能是由于随着超声时间的延长，溶剂体系的渗透压接近平衡，色素随着溶剂向细胞外缓慢扩散[13]，从而表现为提取液的吸光度增加缓慢。所以本试验选择了超声时间为60 min。

2.5 色素超声辅助提取的响应面法优化

2.5.1 中心复合实验设计（central composite design，CCD）设计及其试验结果

在超声辅助提取胭脂果色素工艺的过程中，单因素试验可以考察不同条件对胭脂果素色提取的影响，而响应面分析法则可以同时考察多因素相互作用下胭脂果素色的提取效果，更直观的反应各因素的影响情况和程度[14]。在探究胭脂果素色提取的过程中，适当超声的引入有利于提高胭脂果色素的提取率，但大功率的超声的使用则产生反作用，由此可见，超声功率是构建胭脂果色素的提取的关键性因素，故选取超声功率作为响应面分析的影响因素。此外，在单因素试验中，一定范围内的液固比和超声时间对胭脂果素色的提取的影响较为显著，故将其作为响应面分析的影响因素。因此，采用Design-Expert 8.05 软件[15]中的中心复合实验设计（central composite design，CCD）法对色素提取体系中液固比、超声时间和超声功率对色素提取的影响进行探究。根据CCD 设计原理，液固比、超声时间和超声功率各设置3 个水平，因素水平表见表2。

表2 响应面优化超声辅助提取试验的因素与水平值Table 2 Factors and levels of response surface optimization for ultrasonic assisted extraction test

通过Design-Expert 8.05 分析软件获得的试验方案及其采用该方案获得的试验结果如表3所示。

表3 CCD试验设计及试验结果Table 3 CCD test design and experimental results

续表3 CCD试验设计及试验结果Continue table 3 CCD test design and experimental results

2.5.2 回归和方差分析

以胭脂果色素的提取为响应值，在响应面分析软件中对液固比、超声时间和超声功率进行回归拟合，响应值R（吸光度）与各影响因子间的回归方程为：

R=0.81+0.14A+0.020B+0.052C-6.000×10-3AB+0.010AC+0.036BC-0.027A2-0.045B2-0.054C2所得模拟方程具有较好的相关性，相关系数为R2=0.988 4。此外，对回归模型进行了方差分析，结果如表4所示。

表4 色素提取回归方差分析结果Table 4 Regression variance analysis results of pigment extraction

建立模型的P＜0.000 1，具有高度显著性，失拟项的P＞0.1，无显著性，由此可见，所建模型可用于色素提取的响应面分析。此外，A、B、C、A2、B2、C2项的P值均小于0.05，表现出显著性，这表明液固比、超声时间和超声功率均为提取过程中影响色素提取的主要因素，其中，A、A2、C2项的P＜0.000 1，即液固比对色素提取的影响高度显著。AB、AC、BC项中，仅有AC的P＜0.05，这表明液固比和超声功率对色素提取的影响在一定程度上表现出交互作用，而其他因素间则无此效应。

2.5.3 响应面分析

各因素及其交互作用对超声辅助提取影响的响应面图见5。

图5显示了液固比（A）、液固比超声时间（B）和超声功率（C）3 个因素对胭脂果色素提取的等高线图（a、c、e）和3D 响应面图（b、d、f）。由图5a 可以看出，沿着B因素（超声时间）向峰值方向移动，其等高线的密度明显低于沿A因素（液固比）方向，由此可见，相对于超声时间，液固比对胭脂果色素提取的影响更为显著。由对应的3D 响应面图（5b）也能获取相同的结果，在B因素方向，响应面曲线较为平缓，说明超声功率对色素提取的影响较小，随超声时间的增加，色素提取有增加的趋势，但增加的程度并不大，影响并不十分显著，而沿A因素方向则出现了较为明显的变化，响应面曲线较陡，液固比引起色素提取的变化较大，说明液固比色素提取的影响大于超声时间。

图5c和图5d则显示了A 因素（液固比）和C 因素（超声功率）对色素提取的影响。由等高线图可以看出，沿着C 因素（超声功率）向峰值方向移动的等高线密度也要相对低于沿A 因素（液固比）方向。由3D 响应面图则可以看出，在A 因素方向响应面曲线有一定的坡度，但是，在C 因素方向，响应面曲线较为平缓，说明超声功率对色素提取的影响较小，随超声功率的增加，色素提取有增加的趋势，但增加的程度并不大，影响并不十分显著。由此可见，A 因素变化对结果的影响要高于C 因素，即相对于超声功率，液固比的影响更大。

图5 各因素及其交互作用对超声辅助提取影响的响应面图Fig.5 Response surface diagram of each factor and its interaction effect on ultrasonic assisted extraction

由图5e和图5f可以比较B 因素（超声时间）和C因素（超声功率）对色素提取的影响。由两因素沿峰值方向的等高线密度及其3D 响应面图中响应面曲线的陡峭程度可以看出，B、C 两因素的影响也存在较大差异，相对于超声功率，超声时间的影响较弱一些。响应面分析直观反映了各因素的影响情况，其效果优于单因素试验，综合分析可以发现，3 个因素对色素提取的影响有所不同，其程度大小为：液固比＞超声功率＞超声时间。

通过响应面分析模型对色素提取条件进行了优化分析，预测的最优条件为：液固比16.82∶1（mL/g）、超声时间45.96 min、超声功率475.85 W，预测的最优色素提取吸光度值为0.959。为了提取色素试验的可控性和可行性，对预测条件进行了修正：液固比17∶1（mL/g）、超声时间46 min、超声功率480 W。通过试验检验最优预测条件下的提取效果，色素提取吸光度值与预测值相接近，达到0.94，相差0.019。

3 结论

以胭脂果为研究对象，采用超声辅助手段对胭脂果的色素进行提取。通过单因素试验可知液固比、超声功率和超声时间对色素提取均有显著影响作用。通过响应面分析模型对色素提取条件进行了优化分析，预测的最优条件为0.959。通过试验检验最优预测条件下的提取效果，色素提取吸光度值与预测值相接近，达到0.94，相差0.019。