蓝莓果渣花青素的超声提取及组成分析

叶红玲，姚军，刘冬，徐基艳，陈雪

（1.安庆职业技术学院园林园艺系，安徽 安庆 246003；2.安庆市食品药品检验中心，安徽 安庆 246000；3.合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽 合肥 230009）

花青素广泛存在于多种水果和蔬菜中，不仅赋予果蔬以鲜艳的颜色，对人类健康也具有重要作用。邹小波等[1]从玫瑰、蓝莓等原料中提取天然花青素，与壳聚糖混合制成抗氧化复合膜用于食品保藏；秦朝等[2]的研究表明花青素能有效抑制肿瘤组织中高表达的谷胱甘肽S-转移酶-π，可用于治疗非小细胞肺癌。姚佳宇等[3]指出蓝莓花青素能有效预防和治疗屈光不正、青光眼、视网膜损伤等多种眼部病症。

蓝莓因花青素含量极高，食用、药用价值得到广泛关注，近十年来产业发展迅速[4-6]。据统计，2017年全国蓝莓种植面积达46 891 公顷，总产量约114 905 吨。预计到2026年中国蓝莓年产量可达100 万吨，将成为全球第一大蓝莓生产国。蓝莓果实除了供应鲜食之外，加工率约占总产量的45%，主要应用于蓝莓相关食品、药品、保健品和化妆品领域[7-10]。蓝莓加工中产生的大量果渣利用率极低，造成了蓝莓资源的浪费。本研究以超声波辅助乙醇溶液提取蓝莓果渣中花青素，通过对提取工艺的优化，以期为蓝莓资源的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓果渣：安庆市锦华蓝莓有限公司。蓝莓榨汁后剩余果渣于40 ℃鼓风干燥箱内恒温干燥，至含水量10%进行粉碎，过80 目筛，收集筛下的果渣粉作为花青素提取原料。

花青素标准品：美国Sigma 公司；其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

U3000 液相色谱仪：美国戴安公司；ZOLLO-650CT超声波提取机：上海左乐仪器有限公司；UY120 型电子精密天平：日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 花青素提取率的测定方法

依据LEE 等[11]的方法，以矢车菊3-O-葡萄糖苷为参照，采用双波长pH 示差法测定提取液中花青素含量，并按下式计算提取率。

花青素提取率/（mg/g）=（A×M×K×100）/（ε×L）

式中：A =（A510nm，pH1.0- A700nm，pH1.0）-（A510nm，pH4.5-A700nm，pH4.5）；M 为矢车菊 3-O-葡萄糖苷相对分子质量，449.21 g/mol；K 为溶液稀释倍数；ε 为矢车菊 3-O-葡萄糖苷的摩尔消光系数，26 900 L/（mol·cm）；L 为比色皿光程，1 cm。

1.3.2 单因素试验

称取1 g 蓝莓果渣粉，移入一定体积酸性乙醇提取液。分别考察提取液中乙醇体积分数（50%、60%、70%、80%）、乙醇溶液 pH 值（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0）、提取时间（10、20、30、40、50 min）、料液比[1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45（g/mL）]、超声功率（100、200、300、400 W）、提取温度（30、40、50、60、70 ℃）对提取率的影响。

1.3.3 正交试验

以单因素试验为基础，选择乙醇溶液pH 值、提取时间、料液比、超声功率4个因素，实施L9（34）正交试验，优化花青素提取工艺参数，因素和水平安排见表1。

1.3.4 蓝莓果渣花青素的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分析

按NY/T2640-2014《植物源性食品中花青素的测定》中规定的方法进行样品前处理，并用高效液相色谱分析果渣中花青素组成成分[12]。

表1 正交试验设计Table 1 The design of orthogonal experiment

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数的确定

提取液中乙醇体积分数对提取率的影响见图1。

图1 提取液中乙醇体积分数对提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on anthocyanin yield

由图1可以看出，当提取液中乙醇体积分数由50%逐渐增加到80%时，70%的乙醇溶液对花青素的提取效果最佳。增加或减少提取液中乙醇浓度，提取率都表现不同程度的降低。这是因为乙醇溶液极性随浓度的变化而变化，适宜的极性条件能促进花青素的溶出，当溶液极性超出一定限值时，反而不利于花青素的提取[13]。因此确定提取液中乙醇体积分数为70%。

2.1.2 乙醇溶液pH 值的确定

孙倩怡等[14]曾在研究中指出蓝莓花青素在酸性条件下更稳定，潘利华等[9]的研究结果也表明，当乙醇提取溶液的pH 值由4.0 增加至7.0 时，随pH 值的增加，蓝莓花青素的提取率逐渐降低。固定其他工艺参数不变，不同pH 值的乙醇溶液对花青素提取率的影响如图2所示。

pH 3.0 的乙醇溶液提取效果最优，每克果渣中花青素提取量可达7.23 mg。当乙醇溶液pH 值继续增加至4.0 时，花青素的提取率降至5.88 mg/g，降幅约为19%。因此确定乙醇溶液的pH 值为3.0。

2.1.3 提取时间的确定

超声时间对提取率的影响见图3。

图2 乙醇溶液pH值对提取率的影响Fig.2 Effect of solvent pH on anthocyanin yield

图3 超声时间对提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on anthocyanin yield

如图3所示，当提取时间由10 min 增加至20 min时，花青素提取率呈明显上升趋势，增幅约为15%，并在20 min 时达到峰值，此后再继续延长提取时间，花青素提取率不再显著增加。这可能是因为超声辅助提取20 min，果渣中花青素提取已经较完全或提取液的提取能力达到饱和。因此确定超声时间为20 min。

2.1.4 料液比的确定

料液比对提取率的影响见图4。

图4 料液比对提取率的影响Fig.4 Effect of material-to-liquid ratio on anthocyanin yield

由图4可以看出，当料液比在 1∶15（g/mL）～1∶30（g/mL）范围内，花青素提取率和料液比呈正相关，当料液比至 1∶30（g/mL）时，提取率达到 9.48 mg/g，此后继续加大提取液用量，花青素提取率变化较小。这说明当料液比达到1∶30（g/mL）时，果渣中花青素已经充分提取，再持续增大料液比，为后续浓缩处理增加负担，也会造成成本增加。因此料液比确定为 1∶30（g/mL）。

2.1.5 超声功率的确定

超声功率对提取率的影响见图5。

图5 超声功率对提取率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic power on anthocyanin yield

从图5中可见，当超声功率增至200 W（超声提取2 s，间歇4 s）时，每克果渣中花青素提取率可达9.53 mg。超声功率高于或低于200 W（超声提取2 s，间歇4 s），花青素提取效果都呈现不同程度的降低。这是因为一定功率的超声波可以促进花青素的溶出，但超过一定强度，可能会破坏其化学键，而导致花青素的分解，对提取不利[15]。因此超声功率确定为200 W（超声提取2 s，间歇4 s）。

2.1.6 超声温度的确定

超声温度对提取率的影响见图6。

图6 超声温度对提取率的影响Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on anthocyanin yield

从图6中可看出，当超声提取温度由30 ℃增加到70 ℃时，提取率随温度的升高而降低。这是因为蓝莓花青素对热不稳定，提取温度过高或超声过程产生的热量过高都可能导致花青素的热分解[14，16-17]。据此，确定超声提取温度为30 ℃。

2.2 正交试验结果

依据单因素试验结果，对影响蓝莓果渣花青素提取效果的4个主要因素，即乙醇溶液pH 值（A）、提取时间（B）、料液比（C）和超声功率（D），进行L9（34）正交试验优化提取工艺，结果见表2所示。

表2 正交试验设计与结果Table 2 The analysis results of orthogonal experiment

续表2 正交试验设计与结果Continue table 2 The analysis results of orthogonal experiment

4个因素对蓝莓果渣花青素提取效果的显著性依次是：超声功率＞提取时间＞乙醇溶液pH 值＞料液比。依据均值的结果，最优提取工艺应为A1B3C2D2。但9 组正交试验中，第二组试验（A1B2C2D2）提取率最高，每克果渣可提取9.99 毫克花青素。对A1B3C2D2组合的试验方案进行花青素提取验证试验，测定提取率为10.02 mg/g，两组试验提取率相差甚微，从生产时间和仪器使用成本考虑，推荐超声波辅助乙醇溶液提取蓝莓果渣中花青素最佳提取条件为：A1B2C2D2，即乙醇溶液pH 值为2.5、超声提取时间 20 min、料液比 1∶30（g/mL）、超声提取功率200 W（超声提取2 s，间歇4 s）。

2.3 花青素组成成分分析结果

现已发现蓝莓果中花青素约有16 种，且不同品种蓝莓果中花青素的组成和含量存在差异[18-20]。本试验所用的蓝莓果渣为兔眼系列和南高系列蓝莓鲜果1∶1（质量比）混合榨汁后剩余果渣。按1.3.4 中方法进行样品前处理和色谱分析，HPLC 分析结果如图7所示。

图7 蓝莓花青素提取物HPLC图谱Fig.7 HPLC chromatogram of anthocyanin extract from blueberry

花青素提取液中共有飞燕草等5 种色素，按质量分数从大到小的顺序为：锦葵色素（36.26%）、飞燕草色素（24.08 %）、矢车菊色素（22.08 %）、矮牵牛色素（12.53%）和芍药色素（5.05%），详见表3所示。

表3 蓝莓果渣花青素成分分析Table 3 Analysis of anthocyanin composition in blueberry pomace

3 结论

本试验选用超声波辅助乙醇溶液提取蓝莓果渣中花青素，经正交试验优化后确定最佳工艺为：以pH 2.5 体积分数70 %的乙醇溶液为提取液、超声功率200 W（超声提取 2 s，间歇 4 s）、料液比 1∶30（g/mL）、30 ℃超声提取20 min，蓝莓果渣中花青素提取率为9.99 mg/g。

果渣中花青素提取物的HPLC 分析结果表明，果渣中含有飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、芍药色素和锦葵色素5 种蓝莓花青素，分别占花青素总量的24.08%、22.08%、12.53%、5.05%、36.26%。