UPLC-TUV同时测定双黄连口服液中3种有效成分

陈 静，张 娜,张培训，李雅男，郭 莉

(1.保定冀中药业有限公司，河北保定 071000； 2.河北省中兽药工程技术研究中心,河北保定 071500)

双黄连口服液临床用药广泛，是目前抗病毒、治疗呼吸道感染性疾病的首选药之一。《中华人民共和国兽药典》2015版采用2种流动相分别检测黄芩苷、绿原酸、连翘苷的含量，过程复杂、耗时较长[1]。贺国彬等[2-4]建立了HPLC同时检测双黄连制剂中多种成分的方法，大大缩短了更换流动相需要的配制及平衡时间，但是由于HPLC系统自身的特点，单针样品的分析周期仍在60 min以上。近年来，顾媛媛[5-7]等人采用UPLC-MS或UPLC-MS-MS的方法对双黄连制剂中3种或多种有效成分进行了含量测定方法的摸索，极大提高了灵敏度和工作效率，可由于质谱仪高昂的价格及检测费用使这些方法仅停留在研究阶段，难以推广应用。本试验在前期研究的基础上，建立了UPLC-TUV同时测定双黄连口服液黄芩苷、绿原酸、连翘苷的含量的分析方法，该方法准确、快速、灵敏度高，为双黄连口服液多成分的快速分析奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 仪器和试药 Acquity UPLC H-Class 超高效液相系统，Acquity UPLC TUV紫外检测器，BEH C18色谱柱 (2.1 mm×100 mm,1.7 μm )，Masslynx色谱工作站(美国Waters公司)、CPA225D电子分析天平(德国Sartorius公司)。黄芩苷对照品(批号：Z0271705，纯度为96.8%)，绿原酸对照品(批号：Z0261702)，连翘苷对照品(批号：110821-201615，纯度为94.9%)均购自中国兽医药品监察所。双黄连口服液(保定冀中药业有限公司，规格：100 mL/瓶，批号：201810008)，乙腈(Merck公司，色谱纯)，甲酸(Fisher Scientific，色谱纯，批号：106055A)

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈(A)-0.1%甲酸(B)梯度洗脱(0～0.3 min，5%～10%A；0.3～2.0 min，10%～10%A；2.0～4.0 min，10%～13%A；4.0～4.01 min，13%～15%A；4.01～9.0 min，15%～15%A；9.0～12.0 min，15%～20%A；12.0～15.0 min，20%～25%A；15.0～20.0 min，25%～80%A；20.0～20.01 min，80%～5%A；)；检测波长为278 nm，流速：0.3 mL/min，柱温：25 ℃。

1.2.2 对照品溶液的制备 取黄芩苷对照品、绿原酸对照品、连翘苷对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1 mL含黄芩苷150 μg、绿原酸9 μg、连翘苷6.0 μg的储备液。再分别精密量取各个对照品储备液，加30%甲醇制成每1 mL含黄芩苷5 μg、绿原酸0.3 μg、连翘苷0.2 μg的混合对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备 精密量取双黄连口服液1 mL，置50 mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，再精密量取1 mL加50%甲醇稀释至10 mL，摇匀，再精密量取1 mL加30%甲醇稀释至8 mL，摇匀，过滤，即得。

1.2.4 阴性双黄连口服液的制备 参照《中华人民共和国兽药典》2015版二部分别制备缺黄芩、缺金银花和缺连翘的阴性双黄连口服液。

2 结果和分析

2.1 方法学考察

2.1.1 专属性 通过对比双黄连口服液样品和自行制备的各个阴性样品，记录色谱图，结果表明在与黄芩苷对照品(保留时间13.15 min)、绿原酸对照品(保留时间2.45 min)、连翘苷对照品(保留时间14.05 min)保留时间一致处，双黄连口服液中均见相对应的色谱峰。同时各阴性样品在与3种对照品保留时间一致处无干扰(图1)，因此，该方法的专属性良好。

图1 混合对照品超高效液相色谱图Fig 1 UPLC chromatograms of mixed standards

图2 双黄连口服液超高效液相色谱图Fig 2 UPLC chromatograms of Shuanghuanglian Oral Liquid

1：缺连翘阴性； 2：缺金银花阴性； 3:缺黄芩阴性图3 缺味阴性样品超高效液相色谱图Fig 3 UPLC chromatograms of negative samples

2.1.2 线性 精密量取1.2.2项下的各对照品的储备液各1 mL，加30%甲醇定容至10 mL，即得到黄芩苷、绿原酸、连翘苷浓度分别为15、0.9、0.6 μg/mL的混合对照品溶液母液。精密量取上述溶液0.5、1、2、3 mL置5 mL量瓶中，加30%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得黄芩苷浓度为1.5、3、6、9、15 μg/mL，绿原酸浓度为0.09、0.18、0.36、0.54、0.9 μg/mL，连翘苷浓度为0.06、0.12、0.24、0.36、0.6 μg/mL的标准曲线溶液。照1.2.1液相条件测定，并计算回归方程和相关系数，见表1。

表1 3种对照品的线性关系考察Tab 1 Liner range,regression equation and limit of 3 standards

2.1.3 精密度 取供试品溶液，连续进样6次测定。经计算黄芩苷、绿原酸、连翘苷的峰面积RSD分别为0.16%、0.15%、0.06%，表明该方法精密度良好。

2.1.4 重复性 按1.2.3项下方法制备6份供试品溶液，测得该批产品中黄芩苷、绿原酸、连翘苷的平均含量分别为15、0.9、0.7 mg/mL，RSD分别为0.62%、0.28%、0.69%，结果表明该方法的重复性良好。

2.1.5 稳定性 取2.4项下的同一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样测定，测得黄芩苷、绿原酸、连翘苷峰面积的RSD分别为0.52%、0.65%、0.96%，结果显示黄芩苷、绿原酸、连翘苷在12 h内稳定。

2.1.6 准确度 精密量取已知含量的双黄连口服液样品，分别按约80%，100%，120%比例加入3种质量浓度的对照品溶液，按1.2.3项下制备供试品溶液，按1.2.1项下色谱条件，分别注入色谱仪测定，每个浓度各分别制备3份供试品溶液进行测定，计算回收率和RSD，结果见表2。3种物质的加样回收率均在97%～103%之间，RSD均小于2.5%。

表2 双黄连口服液3种成分加样回收率试验结果(n=9)Tab 2 Recovery results of 3 compands in Shuanghuanglian Oral Liquid(n=9)

2.2 含量测定 取3批双黄连口服液样品，按照上述所建立的色谱方法采用外标法测定。同时与采用《中华人民共和国兽药典》2015版二部收载的含量测定方法比较，结果显示2种方法测定结果基本一致，相对偏差均小于2%，见表3。

3 讨论与结论

3.1 检测波长的选择 据文献报道，结合紫外可见全波段扫描发现，黄芩苷和绿原酸的最大吸收波长分别为 278 nm[8]和327 nm[9]，连翘苷的最大吸收波长为228 nm和277 nm[10]，样品中连翘苷含量较低，且在278 nm处黄芩苷和绿原酸有较好的紫外吸收。因此，选择278 nm吸收波长作为检测波长，既满足了3种成分的检测灵敏度需要，又达到了简化检测方法的目的。

表3 2种方法含量测定结果比较Tab 3 Determinnstion results of comparision of the two methods

3.2 流动相的选择 对比甲醇-0.1%甲酸和乙腈-0.1%甲酸流动相的分离效果，发现乙腈-0.1%甲酸为流动相时绿原酸峰的拖尾得到明显改善，同时黄芩苷的峰形较理想，并通过优化梯度洗脱的程序使各目标峰的分离度、峰形均符合要求。

3.3 进样溶液的选择 试验发现，进样溶液的甲醇浓度对绿原酸色谱峰的峰形影响显著，以30%甲醇为进样溶液时峰形尖锐、对称，分离度良好。最终确定30%甲醇作为进样溶液。

3.4 供试品溶液稳定性考察 我们在进行供试品溶液稳定性考察时发现：黄芩苷的含量在24 h开始降低，同时在保留时间18 min处，有一新物质峰生成，且该新物质峰随着黄芩苷含量的降低峰面积逐渐增大，因此该供试品溶液在12 h内稳定。

3.5 结论 本方法建立了UPLC-TUV法检测双黄连口服液中3种有效成分的方法，前处理简单，快速、准确、重现性好，可用于双黄连口服液的质量控制，为快速有效地控制双黄连口服液提供新的方法。