替米考星颗粒在猪体内的药代动力学研究

封 琦，张笑意，吴 植，郭长明，朱善元*

(1.江苏农牧科技职业学院,江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏泰州 225300； 2.江苏南农高科动物药业有限公司，江苏泰州 225529)

替米考星(Tilmicosin)是一类从泰乐菌素衍生得到的广谱大环内酯类抗生素；Backstrom等[1]发现替米考星在体外对革兰氏阳性菌、支原体以及某些革兰氏阴性菌都有极好的抗菌效果。Du等[2]还发现替米考星可通过改变胞内pH从而对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)产生较强的抗病毒作用。Shen等[3]研究了替米考星在猪体内的药代动力学特性，发现替米考星在动物体内具有吸收快，消除缓慢的特点。替米考星在养猪生产中主要用于预防和治疗呼吸道疾病[4-5]。但替米考星本身味道苦，不耐酸，在胃液作用下降低药效并伤胃。为了解决传统剂型的不足，发展了包被工艺的替米考星颗粒，该技术不仅解决了苦味问题，还实现了药物的肠道溶解，避免了药物对胃的刺激和胃酸对药物的损害，提高了使用效果[6]。本试验研究树脂包被工艺的替米考星颗粒在猪体内的药代动力学特性，并将其作为受试制剂与国际国内市场上的主流产品进行了生物等效性分析，为新药研发和临床用药提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6头健康的阉割过的小公猪，体重(20.7±2.6)kg，购自江苏苏姜种猪有限公司。试验前于实验室动物房隔离器内饲养1 w，期间正常投喂不含任何抗生素的全价料。

1.2 药品和试剂 替米考星标准品(CAS:108050-54-0，规格100 mg，含量93.9%)购自中国药品生物制品检定所；受试制剂替米考星肠溶颗粒(20%树脂包被，T)，由江苏南农高科动物药业有限公司提供；国外参比制剂泰勇(批号C742086，20%替米考星颗粒，R1)，国内参比制剂菲严康(批号DUH161204，20%替米考星粉剂，R2)分别由礼来(上海)动物保健有限公司和河北远征药业有限公司和提供；磷酸、乙酸铵、二丁胺均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙腈、四氢呋喃等色谱纯试剂为TEDIA公司产品。磷酸二丁胺配制采用700 mL纯净水+168 mL二丁胺+70 mL磷酸的顺序依次添加，注意倾倒缓慢并充分搅拌， 待冷却至室温时，用磷酸少量多次添加调节pH至2.5～2.6,加水补齐体积到1000 mL，过滤后备用。

1.3 仪器设备 Agilent-1260高效液相色谱仪, 含四元泵和紫外检测器(美国Agilent公司)；Eppendorf 5424高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；HSE-24D固相萃取装置(天津市恒奥科技发展有限公司)；UGC-24M氮气吹干仪(北京优晟联合科技有限公司)。

1.4 给药方案及采样设计 试验采用随机三制剂、三周期自身交叉试验设计，插胃导管进行口灌给药，根据体重及有效含量换算,每头猪单剂量口服10 mg/kg体重。每次服药间隔清洗期为14 d。服药后分别于5 min、15 min、30 min、45 min、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h前腔静脉采血，每次采血5 mL，置于肝素钠浸润过的塑料离心管中，3500 r/min离心10 min,吸取上层血浆，冰箱-20 ℃冻存。

1.5 血药浓度检测 将SPE柱(BondElute C18，100 mg 5 mL)置于固相萃取装置上，先用10 mL甲醇活化、10 mL超纯水进行平衡；然后精确量取1 mL猪血浆样品，添加0.75 mL 10%高氯酸，12000 r/min离心15 min，取上清液过SPE柱；再用10 mL 5%氨水、5 mL 35%乙腈淋洗；强力抽干10 min后，5 mL洗脱液洗脱于试管中，将其置于30 ℃金属浴条件下用氮气吹至干燥；最后用流动相将其溶解，精确定容至2 mL。涡旋60 s，静置10 min，0.22 μm滤膜进行过滤，供HPLC分析。洗脱液配方及色谱检测条件具体参考农业部国家检测标准[7]：选择Agilent TC -C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色谱柱；以水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氢呋喃(805∶115∶25∶55)为流动相；流速1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为290 nm；进样量为40 μL。

1.6 数据分析 根据所测得血药浓度-时间数据，采用药代动力学软件Kinetica5.0经典房室模型进行曲线拟合，分析药代动力学特性；采用非房室模型主要药代动力学参数进行相对生物利用度评估；采用方差分析、90%置信区间及双单侧t检验进行生物等效性分析[8]。

2 结果与分析

2.1 色谱分离 图1为空白血浆色谱图，由图2可知目标化合物的两个峰与杂质完全分离，无相互干扰；反式异构体与顺式异构体保留时间分别为6.657 min和7.733 min，均控制在8 min左右，提高了分析效率；在药物浓度0.05～20 μg/mL范围内，替米考星峰面积(顺式和反式异构体的峰面积之和)与浓度呈线性相关，其回归方程为Y=674366X-37579，r=0.9996；血浆中检测限(LOD)和定量限(LOQ)采用逐级稀释标准品进样，根据峰面积计算三倍信噪比和十倍信噪比，得到的结果为1.32 μg/L和4.41 μg/L；加标回收率(在0.05～5 μg/mL)为86%～113%；采用1 μg/mL 标准品每天测5次，连测5 d，根据每天和不同天数间峰面积的RSD(相对标准差)计算得到:日内精密度为2.38%～3.02%，日间精密度3.87～5.33%，能满足后续药代动力学分析要求。

2.2 药代动力学分析 三种制剂的平均药时曲线见图3，20%树脂包被替米考星、泰勇、菲严康的血药峰浓度Cmax分别为0.2830、0.2815、0.4087 μg/mL，药物达峰时间Tmax分别为4、0.75、1 h，表明20%树脂包被替米考星药物峰浓度与国外参比制剂泰勇相接近，吸收速率明显慢于泰勇和菲严康。药时曲线房室模型拟合结果表明三种制剂均符合一级吸收，权重为1的二室开放模型，具体药代参数见表1。

图1 空白血浆色谱图Fig 1 Chromatogram of blank plasma

图2 血浆 5 μg/mL替米考星加标色谱图Fig 2 Chromatogram of plasma spiked with 5 μg/mL tilmicosin

图3 三种制剂平均药时浓度曲线Fig 3 Mean plasma concentration-time curves of three formulations

表1 房室模型分析Tab 1 Compartmental analysis

表2 非房室模型分析Tab 2 Non-compartmental analysis

表3 方差分析结果Tab 3 Variance analysis results

NS表差异不显著(P>0.05)

表4 双向单侧t检验及90%置信区间分析结果Tab 4 Results of two one-sided t test and 90% confidence interval analysis

3 讨论与结论

3.1 药代动力学特性 目前关于猪体内的替米考星药代动力学报道，主要以传统剂型磷酸替米考星及替米考星水溶液为主[8-11]。本研究中采用单剂量(10 mg/kg b.w.)口灌给药后，20%树脂包被替米考星颗粒在体内的药时曲线符合带吸收的二室开放模型，这与此前的报道结果相一致[8,12]。其吸收速率常数Ka为0.7003 h-1，小于报道的替米考星原粉(6.586 h-1)及替米考星微囊制剂(2.471 h-1)(按每头猪单剂量30 mg/kg b.w.口灌给药)[12]，这表明20%树脂包被替米考星颗粒比替米考星原粉及替米考星微囊制剂吸收要慢，从而起到了药物缓释作用；其消除速率常数K10为0.0071 h-1，表观清除速率CL/F为0.2259 mg/kg/h，均比报道的磷酸替米考星可溶性粉要小(按每头猪单剂量9.6 mg/kg b.w.口灌给药，K10为0.1456 h-1，CL/F为2.5379 mg/kg/h)，这说明20%树脂包被替米考星颗粒比磷酸替米考星消除要慢；其中央室表观分布容积V/F(c)为32 L/kg同样大于磷酸替米考星(26.2789 L/kg)，这表明20%树脂包被替米考星颗粒组织穿透能力强，很可能在猪肺部出现了药物组织富集[13]；同时将自身参数比较，还可发现K10要远小于Ka，这表明该剂型同样遵循吸收迅速，消除缓慢的药代动力学特性，从侧面验证了前人的结论[3,14-15]。

非房室模型分析发现20%树脂包被替米考星颗粒药物浓度达峰实测值tmax为4 h，要晚于替米考星原粉(tmax-0.75 h)[12]、磷酸替米考星可溶性粉(tmax-2 h，单剂量口服9.6 mg/kg b.w.)[8]、20%磷酸替米考星颗粒Resmitil®(tmax-2 h)[16]以及其余报道(浙江国邦制药有限公司，tmax-3 h)[15]；药物浓度Cmax实测值为0.2830±0.0292 μg/mL,比磷酸替米考星可溶性粉小(0.4818±0.1366 μg/mL，单剂量口服9.6 mg/kg b.w.)，表明药物吸收较慢但比较充分；药物平均驻留时间MRT(75.8230±4.7082 h)和药物消除半衰期t1/2(52.1867±5.6972 h)均大于20%磷酸替米考星颗粒Resmitil®(MRT-27.9±4.4 h；t1/2-23.5±4.7 h)[16],这表明20%树脂包被替米考星颗粒在猪体内的药物作用时间更为持久，消除缓慢，这与经典房室模型分析的药代动力学特征相吻合。

3.2 生物等效性分析 生物等效性分析一般采用非房室模型参数，由tmax参数可知，20%树脂包被替米考星颗粒药物平均达峰时间(4 h)要晚于菲严康(1 h)和泰勇(0.75 h)；从参数Cmax来看，20%树脂包被替米考星颗粒药物峰浓度(0.2830±0.0292 μg/mL)与泰勇(0.2815±0.0291 μg/mL)几乎相等，比菲严康小了几乎1/2(0.4087±0.0421 μg/mL)；这表明20%树脂包被替米考星颗粒在生物安全性上(峰浓度几乎相同)与泰勇接近一致，但要优于菲严康(预实验采用文献报道中的常规剂量30 mg/kg b.w.灌服，出现胃肠道刺激反应)，同时相较于泰勇和菲严康缓释作用明显。

AUC0-∞作为衡量生物等效性的主要关键性指标，同时还能反映出药物在机体内的暴露程度，由相对生物利用度的计算结果可知,20%树脂包被替米考星颗粒AUC0-∞要大于泰勇和菲严康，这表明20%树脂包被替米考星颗粒在体内能够长时间发挥药效。结合方差分析(P>0.05)、双向单侧t检验(t1、t2>t1-0.05(8))及90%置信区间分析(均落在国标规定的80%～125%内)综合判断可得出,20%树脂包被替米考星颗粒、泰勇和菲严康三种制剂间具备生物等效性。

综上所述，本研究结果显示20%树脂包被替米考星颗粒口服给药的总体药代动力学特征与国际、国内参比制剂相吻合，三者之间具有生物等效性，同时还有良好的缓释作用和一定的生物安全性，相较于同类产品在今后的兽医临床用药中具有良好的推广和应用价值。