孤立低高密度脂蛋白胆固醇表型与血浆miR-9-3p、miR-28-5p的表达分析

孙泽宁,吴 冰,2,刘梦迪,李金荣,田 卫,2,周云涛,2△

(1.华北理工大学附属唐山市工人医院，河北唐山 063000;2.唐山市临床分子诊断与治疗重点实验室，河北唐山 063000；3.保定市第一中心医院，河北保定 071000)

孤立低高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)表型是一种单纯的HDL-C水平减低，而三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)值正常的一种表现[1]。孤立低HDL-C表型在亚裔人种中的发生率高于非亚裔人种，与冠心病、卒中的风险增加相关[2]。不仅如此，心血管疾病治疗过程中，尽管他汀类药物强化治疗已经进一步减低了心血管事件和病死风险，但是“剩留风险”问题却更加凸显出来[3]。低HDL-C血症是“剩留风险”发生的重要因素之一。近年来，低HDL-C表型与相关疾病间的分子机制研究已经成为脂代谢领域中的一个重要部分。

miRNA是一类长约22个核苷酸的非蛋白编码的RNA。通过转录后翻译抑制作用，在分子水平参与基因表达和调控。miRNA9(miR-9)是一个靶向调节沉默信息调节因子2家族基因sirtuin-1(SIRT1)的RNA分子，参与糖代谢和脂代谢途径的调节，与胰岛素抵抗关系密切[4]。研究显示，孤立低HDL-C表型人群，除了低HDL-C水平外，也常伴有胰岛素抵抗特征。MIR28是一个通过靶向抑制ERK2，上调HDL-C代谢调节关键基因三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的RNA分子，在HDL-C代谢途径发挥作用[5]。本研究旨在利用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)技术，检测miR-9-3p和miR-28-5p在孤立低HDL-C表型人群血浆中的表达水平，并探讨其与血清HDL-C水平的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取唐山市工人医院2014年1月至2015年12月健康体检者共174例，其中脂代谢表型正常组86例和孤立低HDL-C表型异常组88例。分组参照中国脂代谢异常防治指南、唐山地区健康居民体检血清HDL-C分布特征等[6]，TG<1.7 mmol/L和LDL-C<3.30 mmol/L、血清HDL-C<1.04 mmol/L(男性)或1.16 mmol/L(女性)判别为孤立低HDL-C表型异常组。排除标准：糖尿病、心脑血管病史、代谢综合征等病史。本研究经唐山市工人医院伦理委员会批准，征得受试者的知情同意，并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1血浆RNA提取 参照mirVana RNA分离试剂盒(美国Ambion公司)操作手册。简易操作流程如下：(1) 两步离心法分离血浆样本(4 ℃，3 000 r/min离心15 min，4 ℃，12 000 r/min离心15 min)；(2) 500 μL血浆，经过变性液、酸化苯酚、无水乙醇、洗脱液等处理步骤，分离液相至RNeasy Mini吸附柱内；(3)加入预热90 μL稀释液，静置1 min，8 000×g离心1 min。经血浆RNA分离，起始体积500 μL的血浆样本转化为90 μL RNA样本。

1.2.2血浆miRNA qPCR检测 利用TaqMan miRNA反转录试剂盒、TaqMan miRNA检测试剂盒、TaqMan通用PCR试剂盒(美国ABI公司)，完成miRNA反转录和PCR定量检测(ABI 7500定量PCR仪,美国ABI公司)。反转录反应体系包括：8.6 μL RNA，0.1 μL 100 mmol/L dNTPs，0.1 μL RNase inhibitor (20 U/μL)，1.5 μL miRNA特异度引物,0.5 μL MultiScribeTM反转录酶 (50 U/μL)；反转录反应步骤：16 ℃孵育1 h；42 ℃孵育 1.5 h；85 ℃孵育5 min。定量PCR扩增体系包括：6 μL 反转录产物，10 μL 2×TaqMan通用PCR缓冲液，0.5 μL TaqMan miRNA水解探针(2.5 μmol/L)，3.5 μL H2O(无RNA酶和DNA酶)；反应条件：95 ℃变性15 s，60 s退火/延伸1 min，共50个循环。miRNA相对表达定量分析以miR-191-5p为参照，采用ΔCt方法，计算相对表达水平，2-ΔCt表示血浆样本中的相对表达量。

2 结 果

2.1孤立低HDL-C表型组与脂代谢表型正常组一般资料比较 一般临床资料如表1所示，两组间TC、TG和丙氨酸氨基转移酶(ALT)血清水平，差异有统计学意义，但均在正常参考值范围。

表1 研究对象的临床特征

注：TC为总胆固醇;HDL-C为高密度脂蛋白胆固醇;LDL-C为低密度脂蛋白胆固醇;TG为三酰甘油;FG空腹血糖;ALT为丙氨酸氨基转移酶;AST为门冬氨酸转氨酶;GGT为谷氨酰转肽酶;HGB为血红蛋白浓度;PLT为血小板计数;WBC为白细胞;RBC为红细胞;NEU为中性粒细胞;LYM为淋巴细胞

2.2血浆miR-9-3p和miR-28-5p的检出率 脂代谢表型正常组和孤立低HDL-C表型组血浆中miR-9-3p的检出率分别为86.05%(74/86)和64.77%(57/88)，差异有统计学意义(χ2=10.58,P=0.001),见表2，但性别分组条件下，miR-9-3p在各组间的检出率，差异无统计学意义(χ2=0.66,P=0.882)。miR-28-5p的检出率分别为94.19%(81/86)和100%(88/88)，差异无统计学意义。表观健康体检者血浆中miR-9-3p和miR-28-5p的总检出率分别为75.29%(131/174)和97.13%(169/174)。

表2 血浆miR-9-3p的检出率(n)

注：χ2=10.58,P=0.001，有统计学意义

2.3血浆miR-9-3p和miR-28-5p表达水平 如图1所示，孤立低HDL-C异常表型组与脂代谢正常表型组血浆样本中miR-9-3p相对表达水平分别为0.024(0.009,0.039)和0.026(0.012,0.065)，差异无统计学意义(P=0.167)，图1A；miR-28-5p的相对表达水平分别为0.004(0.002,0.010)和0.004(0.002,0.011)，差异无统计学意义(P=0.871)。见图1B。

图1 血浆miR-9-3p和miR-28-5p的相对表达水平

注：A为性别与表型交互分组情况下血浆miR-9-3p比较分析；B为性别分组情况下血浆miR-9-3p比较分析；C为性别与表型交互分组情况下血浆miR-28-5p比较分析；D为性别分组情况下血浆miR-28-5p比较分析；●表示正常脂表型；○表示孤立低HDL-C表型

图2性别分组下血浆miR-9-3p和miR-28-5p的相对表达水平

2.4性别分组情况下，血浆miR-9-3p和miR-28-5p表达水平 如图2所示，miR-9-3p在女性脂代谢正常组和孤立低HDL-C异常表型组血浆样本中的表达水平均高于男性组，见图2A，与未表型分组情况下女性组高于男性组的分析结果相一致[0.038(0.023,0.082)vs.0.014(0.007,0.033),P<0.001]，见图2B。而在性别和HDL-C异常表型分组条件下，各组间血浆miR-28-5p的差异无统计学意义，见图2C，仅在未表型分组情况下女性组高于男性组[0.003(0.002,0.008)vs.0.004(0.003,0.011),P=0.028)，见图2D。

2.5血浆miR-9-3p和miR-28-5p与临床指标的线性回归分析 如表3所示，线性回归分析显示血浆miR-9-3p与性别因素(P<0.001)、血清HDL-C水平(P=0.041)、空腹血糖(P=0.044)相关，见表3；而miR-28-5p表达水平与血清HDL-C水平、空腹血糖、性别等指标均无相关性。

表3 健康体检者血浆miR-9-3p的线性回归分析

注：多元线性回归模型中包括年龄、血脂、肝功能、血常规细胞绝对计数等指标，非正态分布的数据经自然对数转换，回归模型经年龄等因素调整后R2=0.215,P=0.002

3 讨 论

孤立低HDL-C表型是心脑血管疾病的一个风险因素。该表型人群常表现出内皮细胞功能紊乱、HDL亚组份功能异常[7]、抗炎作用削弱[8]、血小板过渡活化[9]等病理生理特征，而这些改变与心脑血管疾病的发生与发展关系密切。

研究表明，HDL-C代谢过程中，有多种miRNA参与，包括miR-33[10]，miR-28[11]，miR-144[12]等。研究表明，miR-9调节胰岛素分泌[13]，参与胆固醇代谢及心肌细胞血管新生过程[14-15]。冠心病患者常伴有降低的HDL-C水平，并发糖尿病。因此，本研究选取miR-28和miR-9作为研究对象，探讨在孤立低高密度脂蛋白胆固醇表型下的血浆miR-9-3p和miR-28-5p变化模式。结果显示，脂代谢表型正常组和孤立低HDL-C表型组血浆中miR-9-3p的检出率分别为86.05%(74/86)和64.77%(57/88)，差异有统计学意义，同时在女性脂代谢正常表型组和孤立低HDL-C表型组的表达水平均高于男性表型组，差异均有统计学意义。然而，在不考虑性别因素情况下，脂代谢正常表型和孤立低HDL-C表型组间差异无统计学意义。线性回归分析显示性别、血清HDL-C水平和空腹血糖水平是血浆miR-9-3p的主要影响因素，尤其是性别因素，支持了血浆miR-9-3p在脂代谢正常表型和孤立低HDL-C表型中的分布特征。国内外对于孤立低高密度脂蛋白表型的血浆miR-9水平鲜有报道。本研究首次利用孤立低HDL-C表型和正常血脂表型间的微弱差别，证实了血浆miR-9-3p的基线特征及其关联因素，为其在动脉硬化性疾病和糖尿病的关联研究提供了基础数据支持。人类miR-9基因定位于3个不同的染色体(1号、5号和15号)基因座位，增加了其转录调控模式复杂性，有可能影响血浆miR-9-3p的分布水平。其不同基因座位对血浆miR-9-3p表达模式的影响有待于进一步深入研究，以期为亚临床、临床疾病诊疗的转化与应用奠定坚实的基础。

miR-28属于内含子型的miRNA分子，与LIM域脂肪瘤优先运输辅基编码基因(LPP)协同转录加工。研究表明LPP基因及其内含子型miR-28分子与动脉粥样硬化性疾病关系密切。本研究未发现血浆miR-28-5p在健康体检血脂正常表型和孤立低HDL-C表型中存在差异，提示血浆miR-28-5p不是孤立低HDL-C表型的分子病理特征。当前HDL-C的亚组分研究提示，抗动脉粥样硬化的HDL 颗粒是由一组异质亚组分组成，不仅大小和密度不同，其化学成分和生理功能也有所不同[16]。临床实践中，冠心病患者常常伴有其他代谢性疾病，如糖尿病、高脂血症等，其相互关联的因子十分复杂。借助新型miRNA分子谱系特征，能为孤立低HDL-C表型的诊疗以及心血管事件风险预测提供新的研究思路和潜在的干预靶标，从而实现心血管疾病的精准医疗。

4 结 论

血浆miR-9-3p是孤立低HDL-C表型的分子病理特征之一。性别、血清HDL-C、空腹血糖是其循环水平变化的主要关联因素。血浆miR-9-3p在孤立低HDL-C表型的基线特征及其关联因素的发现，将有助于临床工作中更加全面地了解心血管疾病风险因素携带者亚临床表型的分子病理特征，为心血管病的早期防控提供潜在的分子靶标。