保存温度及时间对化学发光法测定直接肾素浓度的影响

邓玲艳，王 旭，李辉军

(华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科，湖北武汉 430030)

原发性醛固酮增多症(PA)，简称原醛症，是指肾上腺皮质病变分泌过多的醛固酮，导致体内潴钠排钾，血容量增多，以及肾素-血管紧张素系统受抑制，以血浆高醛固酮和低肾素水平为主要特征，临床症状表现为高血压伴有(或不伴有)低血钾的综合征[1]，是继发性高血压的主要病因之一，约占难治性高血压的10%左右[2]。研究表明，高血压人群中采用血浆醛固酮与血浆肾素比值(ARR)筛查后，原醛症检出率提高了10倍左右[3]。美国《原发性醛固酮增多症患者诊断治疗指南》[1]和中国《原发性醛固酮增多症诊治专家共识》[4]均推荐ARR作为原醛症的首选筛查指标。

由于原醛症患者肾素水平低，且肾素是ARR的分母，故肾素测定的准确性在很大程度上决定了ARR结果的准确性。肾素测定的传统方法是放射免疫法，其原理是根据肾素可将血管紧张素原转化成血管紧张素I，通过测定血管紧张素I的生成速率来间接反映血浆肾素活性(PRA)。近年来，全自动化学发光法测定血浆直接肾素浓度(DRC)，由于其操作相对放射免疫法测定PRA受影响因素更少、操作更简易、更易于标准化且无放射性污染，逐渐应用于临床[5-6]。

样本稳定性是影响检测结果准确性的一个重要因素。研究表明温度不仅影响PRA[7]，也会影响DRC[8-11]。因为不同实验室DRC稳定性结果并不完全相同[8-11]，所以本研究的目的是调查本实验室血浆中DRC在不同存储温度下的稳定性，为日常工作提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 随机选择健康体检者65例，男35例，女30例，年龄22～56岁，肝肾功能正常，影像学检查显示心脏、肺、肝、脾、肾及肾上腺、子宫及附件、前列腺等重要脏器未见明显异常，未服用任何影响肾素-醛固酮系统的药物[1]。

1.2仪器与试剂 血浆直接肾素浓度在意大利索灵化学发光免疫分析系统 (仪器型号：LIAISON XL) 上进行检测，严格按试剂说明书进行操作。

1.3方法 采用伯乐内分泌质控品进行严格的质量控制，批号40311，累积均值73.9 μIU/mL,CV为3.65%；批号40313，累积均值107.3 μIU/mL，CV4.19%，均值累积时间超过3个月。自制混合血浆，按CLSI文件EP5-A2 验证精密度，浓度14.4 μIU/mL 批内不精密度CV1.0%,总不精密度 3.3%；浓度42.2 μIU/mL 批内不精密度CV2.2%,总不精密度 3.0%。

采用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝真空采血管(BD,美国)于上午7:30-8:30采集空腹静脉血6 mL(立位)，上下颠倒混匀，室温离心(3 000×g，10 min)分离血浆并分装(30 min内完成)，排除严重脂血、溶血、黄疸以及血样体积不足的样本。新鲜样本立即上机检测作为即刻值(基线水平)，其他样本按以下方案储存。

室温稳定性：20支样本，每支分成5等份，分别在室温(25 ℃)放置0、2、4、6、8 h后检测；冷藏稳定性：20支样本，每支分成5等份，分别冷藏(4 ℃)0、2、4、6、8 h后检测；冷冻稳定性：20支样本(由于操作失误，最终只有17支样本检测值纳入计算)每支分成4等份，除新鲜样本外，分别保存在-20 ℃条件下4、8、12周后在37 ℃水浴中快速解冻，并立即检测；冻融稳定性：5支样本，每支分成4等份，新鲜样本立即检测作为基线值，其他3组样本立即冻存于-20 ℃。 第2天,第4组样本在37 ℃水浴中快速解冻，随后再冻存于-20 ℃(解冻-冻存在5 min内完成)；第3天同一时间，第3组、第4组样本重复相同操作；第4天同一时间，3组样本在37 ℃水浴中快速解冻，并立即上机检测。这样，第2组、第3组、第4组样本分别冻融1次、2次、3次。

2 结 果

2.1受试者的一般资料比较 本研究一共选择65例受试者，按照其血压，分成理想血压组(收缩压：90～120 mm Hg、舒张压：60～80 mm Hg)42例；以及正常血压高值组(收缩压：>120 mm Hg～<140 mm Hg、舒张压：>80 mm Hg～<90 mm Hg)23例。正常血压高值组与理想血压组在收缩压、舒张压、体质量指数(BMI)、血清钠离子浓度、血清肌酐、肾小球滤过率(eGFR)的差异有统计学意义(P<0.05)，而DRC、年龄、血清K+浓度在这两组的差异无统计学意义(见表1)。

表1 受试者一般资料

2.2计算DRC差异率可接受标准 查阅文献，DRC在健康人中CVb为30.1%[14]。CVa来源于本实验室质控累积不精密度和验证不精密度：3.3%、3.0%、3.65%、4.19%，计算TCL分别为17.6%、17.2%、18.1%、19.0%。本实验以17%作为肾素浓度差异率可接受标准。

2.3DRC在室温条件下的稳定性 在室温条件下，DRC随放置时间的延长有降低趋势，详见表2。尽管从放置在室温2 h起，DRC检测值与即刻值相比，差异具有统计学意义(P<0.05)，但是放置2 h和放置4 h所有样本DRC的差异率均在17%以内。当室温放置6 h，20例样本中仅有1例DRC测定值从3.63 μIU/mL降至2.79 μIU/mL，差异率为-23.2%。故样本采集后，室温放置6 h内检测，绝大多数DRC降低幅度临床可接受。

表2 室温条件下血浆直接肾素稳定性

注：差异率>17%认为差异临床不可接受；-表示无数据

2.4DRC在冷藏条件下的稳定性 冷藏条件下，DRC随放置时间延长有升高趋势，见表3。研究发现，从冷藏2 h开始，DRC检测值与即刻值相比，差异具有统计学意义(P<0.05)，而直到冷藏4 h开始，有2个样本的差异率超过了TCL(分别为2.48 μIU/mL升高至2.94 μIU/mL，差异率18.6%，19.02 μIU/mL升高至25.14 μIU/mL，差异率32.2%)，并且随冷藏时间延长，差异率超过TCL的比例逐渐增多。

表3 冷藏条件下血浆直接肾素稳定性

注：差异率>17%认为差异临床不可接受；-表示无数据

2.5DRC在冷冻条件下的稳定性 研究DRC在冷冻条件下的稳定性之前，先观察DRC的冻融稳定性。冻融可使DRC降低，并且随着冻融次数增加，DRC检测值逐渐降低，见表4。当分离后的血浆样本保存在-20 ℃条件下12周时，DRC的降低幅度临床可接受，见表5。

表4 血浆直接肾素冻融稳定性

表5 冷冻条件下血浆直接肾素稳定性

注：差异率>17%认为差异临床不可接受；-表示无数据

3 讨 论

肾素由肾小球旁细胞合成，或由肾素原在一定条件下转化生成[15]。肾素原是肾素的前体，在血浆中以两种构象存在，一种是无活性形式，其活性位点被它N段的一个多肽片段封闭，大概占总量的98%；另一种是活性形式，虽然也含有prosegment，但活性位点未被封闭，这种有活性的含量非常少，不到2%，故健康者外周血中，肾素原的活性非常低。但在低温(-5 ℃～4 ℃)条件下，无活性肾素原的prosegment可以打开，变成有活性的形式，这一过程被称为肾素原的冷激活[15]。由于血浆中的肾素原浓度约为肾素的10倍,在肾素分泌受抑制的患者(如原醛症患者)体内，肾素原的浓度可较肾素浓度高100倍[15]，所以少量肾素原激活都会使肾素浓度检测产生较大影响。

基于肾素原上述特性，当血液样本置于低温环境时，肾素原被冷激活转换为活性肾素，从而影响肾素测定值的准确性。然而，若样本放置在室温时间过长，肾素也可能由于氧化、变性和构象变化等原因导致浓度降低。相关指南和共识[1,4]建议，用于肾素检测的样本，从采集、转运到分离血浆的时间不宜超过30 min，这在日常工作中往往难以做到，尤其当需要将样本转运至第三方机构检测时。本研究表明，肾素不稳定，直接肾素离体后，不管是保存在室温还是冷藏条件下，短时间(2 h)内的变化差异有统计学意义。进一步分析表明，血浆放置在室温6 h及冷藏2 h时，DRC变化幅度可接受。由于样本冷藏运输较常温运输繁琐，因此样本宜保存在室温并在采集后的6 h内送到实验室。当分离出的血浆样本冷冻(-20 ℃)12周时，直接肾素的变化幅度可接受，这与李溪月等[11]的建议一致。此外，本实验首次研究直接肾素的冻融稳定性，发现冻融会使DRC降低，仅能冻融一次。

查阅文献，在相同的检测系统，GRUSON等[8]发现DRC放置在室温有下降趋势，6 h差异开始有统计学意义，他们建议样本采集后6 h内送检，与本文的建议相同；GLINICKI等[9]研究表明在样本采集后20～30 min内，DRC在室温条件下变化不显著；LOCSEI等[10]发现当样本放置在室温2 h时，DRC显著降低，但在0℃～5℃条件下2 h，DRC变化不显著。李溪月等[11]发现室温放置6 h，冷藏3 h，DRC的差异均有统计学意义。本研究结果显示，在冷冻或冷藏2 h后，与基线值比，DRC的均值差异均有统计学意义。几个实验室对均值统计的结果的不一样，可能与人种不同，实验室环境不同等因素有关。但是，上述其他国内外的研究在数据分析时，仅对血浆DRC的均值做了χ2分析或t检验，都未将检测系统的分析变异和个体内生物学变异考虑在内，这可能是导致本次研究结果和其他研究结果不完全相同的主要原因。

在临床上，由于血浆肾素与醛固酮一起，主要用于原醛症的筛查及原发性高血压的病因分析，而正常血压高值往往认为是原发性高血压的前期。因此，在本研究中，笔者对纳入的健康人群进行了理想血压和正常血压高值的分组，发现DRC在两组中差异无统计学意义。然而，血浆中DRC被抑制是原醛症的特征之一，不同贮存条件是否会影响原醛症的筛查效率，有待进一步的研究。此外，本研究验证另外一个有趣的现象，即在健康体检者中，DRC明显异于说明书推荐的参考区间(立位：4.4～46.1 mIU/L)，可能与种族不同有关[16]。

4 结 论

本实验研究显示，外周血中肾素浓度不稳定。在室温条件下，随保存时间延长降低；在冷藏条件下，随保存时间延长升高；本实验首次研究DRC冻融稳定性，DRC随冻融次数增加而降低。因此，样本采集后应在6 h内送检并检测，若来不及检测，可冻存于-20 ℃至少12周，应避免反复冻融。