电感耦合等离子体质谱仪在血流感染早期诊断中的初步应用

赵苏瑛,蒋 维△,吴 倩

(1.南京中医药大学附属医院，江苏南京 210029；2.南京医科大学公共卫生学院，江苏南京 210029)

目前将败血症和菌血症统称为血流感染，血流感染是一种严重的全身性感染综合征。近年来，随着创伤性诊疗技术的广泛开展以及广谱抗菌药物、激素和免疫抑制剂的广泛使用，血流感染的发病率有逐年增高的趋势。据报道，全球每年大约发生200 000例血流感染，病死率在25%～60%[1-2]。血流感染的常见菌有金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌，肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌及凝固酶阴性的葡萄球菌等。由于传统的培养耗时长，细菌的耐药性变化大且与细菌本身的毒力和侵入的途径和数量均相关，发生血流感染的患者很难在早期获得有效地治疗，而早期诊断早期用药对降低血流感染病死率，改善预后至关重要。当前，传统的血培养仍然是诊断血流感染的金标准，但是它耗时长，敏感度低并且对于采集时间有严格的要求，更重要的一点是血培养对于某些细菌是无效的。因此，亟需一种高效快速且能早期诊断血流感染的方法。

在医学微生物的鉴定领域，质谱法近年来得到飞速发展，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)现在已经广泛应用于临床微生物的鉴定，但是对于血流感染，必须先获得纯培养才能进一步鉴定，相对于传统方法来说，节省的时间很有限，而电感耦后等离子体质谱仪(ICP-MS)可以直接测定血液样本中的金属离子含量不需经过传统的培养步骤，因此在血流感染的早期诊断方面拥有广阔的应用 前景。

1 材料与方法

1.1研究对象 本实验一共收集了58例血流感染患者的血液标本，将血液经增菌培养后获得纯培养菌落。其中14例患者为葡萄球菌感染，包括金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌等，患者平均(65.57±15.82)岁，男11例，女3例；39例为肠杆菌科细菌感染，包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等；平均(68.64±10.33)岁,男20例，女19例；5例感染肠球菌，主要为屎肠球菌和粪肠球菌，平均(71.00±14.16)岁，男2例，女3例；阴性对照组58例，平均(63.30±8.88)岁,男38例，女15例。

1.2试验材料 5种HPLC级混标液购自上海凯莱生物，定标液购自中国国家有色金属及电子材料分析测试中心，实验用超纯水由美国Milli-Q超纯水仪制造，所有的试剂和化学用品均采用分析级。

1.3样品制备 经知情同意后，抽取血流感染患者组和健康对照组5 mL外周血，3 500 r/min离心10 min分离血清，置于-20 ℃保存。使用前在室温下融解并振荡混匀5 min，然后在200 μL血清内加入600 μL浓硝酸和50 μL内标液。混合溶液在85℃孵育2.5 h后加入去离子水至5 mL，置于4 ℃待检。

使用注射器吸取0.5 μL血流感染患者的全血注入10 mL增菌液中37 ℃孵育过夜，然后取1 mL菌液转至新鲜培养基中，调整OD值使之介于0.3～0.6之间，取2 mL培养基12 000× g离心5 min，收集上清液，重复上述操作[3]。

1.4金属元素分析 本试验均采用PICAP Q ICP质谱仪(美国，Thermo公司)，一共测定68种金属元素。

1.5数据分析

1.5.1试验数据处理 ICP-MS工作站导出的半定量结果用二维数据矩阵表示，金属元素分布图用GraphPad prism 6软件绘制。

1.5.2金属元素的挑选 为了寻找两组之间的差异，本文使用SIMCA软件包(SIMCAP 13.0)对数据进行多维和一维统计分析。所有的数据在经过简单归一化后输入到软件中，然后进行主成分分析(PCA)，找出观察组之间金属元素最主要的趋势。之后再用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)分析组间变异性以期更好地揭示群体结构，在PLS-DA中VI1被认为组间差异具有统计学意义，本文将VI1的数据进一步行t检验[4-5]。此外q检验被用来降低假阳性率和过拟合。那些同时符合VI1且P<0.05的金属元素被认为具有统计学意义，可作为潜在的标志物[6]。

1.5.3统计学处理 使用OriginPro 9进行相关性分析，分析方法选用Pearson检验，并绘制拟合曲线。

2 结 果

2.1血流感染时金属元素分布情况 发生血流感染时金属元素的分布如图1所示。PLS-DA的模型图如图2所示，PLS-DA的基本参数如表1所示，R2Y(累积的因变量指数) 和Q2Y(交叉验证的有效性指数)均大于0.7，表明该模型稳定、可靠，见表1。

2.2潜在标志物的选择 根据VIP值和P值确定潜在金属标记物，先用VI1初步筛选，再用方差分析进一步验证，P<0.05被认为差异具有统计学意义。挑选出的潜在金属标记物如表2所示。为了在其中挑选出有意义的金属元素，本文进一步使用Pearson相关分析来评估那些浓度水平明显不同的元素，如表3所示，钯、金、钍和锡在四种类型的血流感染中均出现了浓度的变化，在3种类型的血流感染中出现浓度变化的有锂、锑和锌，而另外的一些元素，如锶、钙、铌和硒等则在其中两个类型的血流感染中出现明显的浓度变化，还有一些则在某一特定类型血流感染中出现浓度变化。如表4所示，钙与金黄色葡萄球菌血流感染呈负相关性，钯和金与大肠埃希菌的血流感染呈正相关性。

表1 PLS-DA 参数

注：A为血流感染患者血清金属元素分布;B为金黄色葡萄球菌血流感染患者血清金属元素分布;C为大肠埃希菌血流感染患者血清金属元素分布;D为肠球菌血流感染患者血清金属元素分布;E为肺炎克雷伯菌血流感染病人血清金属元素分布

图1血流感染患者血清中金属元素分布图

表2 血流感染患者血清中的DME

续表2 血流感染患者血清中的DME

注：A为血流感染组；B为金黄色葡萄球菌血流感染组；C为大肠埃希菌血流感染组；D为屎肠球菌血流感染组；E为肺炎克雷伯菌血流感染组

图2血流感染时金属元素的PLS-DA模型

表3 不同感染类型浓度明显改变的元素一览表

表4 金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌血流感染中 DME的相关性分析

3 讨 论

本研究中笔者共测量了58份标本，68种金属元素，获得了血流感染患者体内的金属元素分布图谱，这不仅有助于区分健康个体与血流感染患者，而且对研究该疾病的发病途径也具有重要意义。依托ICP-MS的先进技术，使得在数小时内获得可靠结果成为可能，毫无疑问，这将给临床提供一个微生物感染诊断的新平台[7]。

很多细菌感染都伴随着体内微量金属离子浓度的异常改变。随着现代医学的发展，越来越多的学者开始关注金属元素与疾病之间的关系。

生物体内元素的变化与体内环境和代谢有关。在体内环境保持不变的情况下，一些疾病引发的金属代谢障碍会导致体内元素紊乱，但是具体机制很复杂，目前仍在研究中。与对照组相比，发生血流感染的患者血清中金属元素有一些发生了明显的变化，本文认为这些变化与感染及发生感染的种类有关。一方面，由于体内金属元素水平的不稳定，一些炎症因子的活性和含量受到影响，从而影响细胞免疫水平，进一步影响血流感染的发生和进展。

在发生感染时本文检测到铂、金、钍和锡的浓度均有改变，除个别患者因为机体的排泄功能异常导致的元素浓度异常外，本文认为这与这些金属的功能有关。如本试验中钯和金在大肠埃希菌血流感染者血清中的浓度与细菌中浓度呈正相关性。已有研究发现大肠埃希菌的产物可以在溶液中结合钯离子[8]。大肠埃希菌至少能产生Hyd-1、Hyd-2和Hyd-3 3种水解酶[9]；Hyd-1和Hyd-2是膜结合的呼吸同工酶，它们的催化亚单位暴露于膜的胞质侧，Hyd-3是甲酸脱氢酶复合体的一部分，这3种氢化酶都有助于钯离子还原[10]。因此血液中钯离子的浓度升高也会使大肠埃希菌的体内钯离子浓度升高，两者表现一致。另外有研究表明金在特定载体上分散成超微粒子后，对很多物质的氧化具有优异的催化性能[11]，细菌能够迅速还原金离子并将其还原成元素金[12]，生物体内的氧化反应众多，因此血清内金离子浓度升高会导致细菌吸附的金离子越多，细菌体内金元素的含量也就越高。

在血流感染中浓度明显改变的金属元素还有锂、铁、锌、钙等。有报道称锂在一些炎性反应中能促进抑炎因子的分泌同时抑制促炎因子的分泌[13]，因此血流感染时会出现血清锂浓度的变化。

金属离子(Cu2+、Zn2+、Sn2+)具有广谱而强大的抑菌作用，根据实验研究，金属离子系列抑菌性物质对大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌等均有杀灭抑制能力。体内铁元素缺乏会导致IL-4和IL-6活性降低，此外，铁依赖性酶和含铁的酶类合成也会受阻，同时CD4和CD8活性的改变，导致CD4/CD8比值下降，机体免疫功能下降[14-15]。锌在体内也参与多种酶的合成[16]，锌元素缺乏会降低这些酶的活性，导致巨噬细胞和体细胞功能紊乱，皮质区T淋巴细胞减少，胸腺萎缩，最终出现体液免疫和细胞免疫功能紊乱，造成免疫缺陷。研究证实，铯对机体的细胞免疫、体液免疫及器官的非特异性免疫有显著影响，铯浓度的降低会抑制免疫球蛋白和抗体的产生，降低抗体滴度，削弱免疫功能，还会造成中性粒细胞趋化作用损伤和吞噬细胞功能低下[17]。本文推测金属代谢的异常诱发了代谢性疾病和免疫力低下，从而导致了血流感染的发生。

血流感染总是伴随着炎症，炎症细胞浸润和组织坏死。某些金属元素的浓度变化可能与炎症有关[18]。在本次试验中，本文发现的大量与血流感染相关的金属元素并不属于体内常见的微量元素，这表明与细菌导致的血流感染相关的元素可能并不仅仅局限于常见的微量元素。

发生感染时，游离在血液中的金属元素与细菌本身的金属元素之间的模式比较目前并无报道，本文在试验中对两者进行比较后发现，钙在金黄色葡萄球菌血流感染者的血清中与在细菌中的浓度呈负相关。金黄色葡萄球菌的毒性与生物膜相关蛋白的结构和模式有关[19]，而钙离子以一种浓度依赖性的方式调节金黄色葡萄球菌生物膜的结构[20]，归根到底，金黄色葡萄球菌的毒性与这些蛋白中的钙离子浓度相关。钙离子作为一种生物多样性必需的碱性金属离子，高浓度时可以破坏金黄色葡萄球菌的生物膜结构，杀伤静止期金黄色葡萄球菌，同时可消除病原菌的耐药性[21]。

钯除了与大肠埃希菌血流感染呈正相关性外，在肠球菌血流感染中浓度也与细菌体内浓度呈正相关性，而铍在血清中的浓度与细菌体内呈负相关性。有数据表明铍会破坏细胞膜成分和结构，影响细菌合成细胞外多糖，导致细菌间聚集力增加，对细菌存在抑制作用[22]。因此发生细菌感染时，铍的浓度降低是可以解释的。

4 结 论

本研究提出了一种基于ICP-MS技术的金属组学方法以期应用于血流感染的早期诊断，本研究建立了细菌血流感染时的金属元素分布图和不同类型细菌感染时的特异性金属分布图，并初步筛选出了潜在的DME。此外还测定了金属元素与感染的相关性，发现了一些特异性的可以进一步深入研究和验证的金属元素。金属组学有望成为一种简单快速的用于临床筛检早期血流感染的有效手段。