黑曲霉1504产葡萄糖氧化酶的酶学特性及对馒头品质的改良

朱运平 褚文丹 黎 芳 李秀婷1，*

（1 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心（北京工商大学） 北京100048 2 北京市食品添加剂工程技术研究中心（北京工商大学） 北京100048 3 北京工商大学食品学院 北京100048）

葡萄糖氧化酶在自然界分布广泛，具有催化特异性强，反应效率高的优点，在食品行业、医药行业、饲料添加等方面得到广泛应用[1-3]。在食品行业，有大量研究表明葡萄糖氧化酶对面制品有良好的改良作用，如Daiva 等[4]研究了GOD 对亚洲面条流变特性的影响；Lele 等[5]研究发现包埋GOD 对商业小麦粉烘焙品质有良好的改良作用；王雨生等[6]发现葡萄糖氧化酶可以改善面包的烘焙品质。在医药行业，GOD 可用于血糖含量测定，GOD 对于β-D-葡萄糖的专一性作用，葡萄糖氧化酶被广泛应用于血糖、尿糖及尿酮体的检查等[7]。在饲料添加方面，在鸡饲料中添加GOD，能催化鸡肠道内葡萄糖产生葡萄糖酸和过氧化氢，抑制大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、弧菌，保护鸡肠道上皮细胞的完整性，改善肠道酸性消化环境，提高饲养鸡的成活率[8]。

微生物种类繁多，生长繁殖速度快，成为生产葡萄糖氧化酶的主要力量，生产葡萄糖氧化酶的主要菌株为青霉和黑曲霉[9-10]。目前关于黑曲霉产葡萄糖氧化酶的报道已有很多，然而酶活力不理想。王志新等[11]提取的黑曲霉A9 产葡萄糖氧化酶的比活力是349.84 U/mg；中国科学院武汉病毒研究所构建的重组酵母所产GOD 比活力为426.25 U/mg[12]。舒正玉等[13]经硫酸铵沉淀、透析、DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子交换层析和Sephadex G-75 凝胶过滤层析得到电泳纯的黑曲霉F044 脂肪酶，纯化倍数为73.71 倍。本研究利用AKTA 蛋白纯化系统，采用浓缩、 盐析和层析相结合的方法，对黑曲霉菌株1504 所产葡萄糖氧化酶进行分离纯化，最终得到电泳纯的葡萄糖氧化酶，同时对其酶学性质进行研究，并将其应用于馒头品质的改良，具有重大研究价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

面粉：中粮雪花粉，中粮集团；活性干酵母，安琪酵母有限公司。

丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷，美国Amresco（USA） 公司；甘氨酸，北京拜尔迪生物公司；DEAE-Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-200，瑞典Amerham（Uppsala）公司；中分子量标准蛋白，美国Sigma 公司；聚乙二醇、硫酸铵葡萄糖、氯化钠、碳酸钙等其它化学试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

SE600 垂直电泳槽及EPS-601 型电泳仪，美国GE 公司；AKTA 蛋白纯化系统，美国GE 公司；Himac CR22G 型高速冷冻离心机，日本Hitachi公司；布拉班德粉质仪、 布拉班德拉伸仪，德国Brabender 公司；SZM-60 搅拌机（和面机），广东旭众食品机械有限公司；欧美佳CV 醒发箱，湖北欧美家食品机械有限公司；质构仪，美国Brookfield公司；ADCI-60 色度仪，北京辰泰克仪器技术有限公司。

1.3 酶的分离纯化

1.3.1 聚乙二醇（PEG-20000） 浓缩 参照张茜等[14]的方法，取实验室发酵粗酶制剂于透析袋，用PEG 20000 将透析袋包埋，在4 ℃过夜浓缩，取浓缩液备用。

1.3.2 硫酸铵分级沉淀 硫酸铵分级沉淀方法参照蛋白质手册以及钟文辉[15-16]的方法，量取一定体积的粗酶液，在冰水浴中，缓慢加入硫酸铵粉末，使硫酸铵质量分数达20%的饱和度，然后继续搅拌1 h，在10 000 r/min 下离心10 min，将沉淀以最少量的缓冲液溶解，收集上清液和沉淀分别测定葡萄糖氧化酶活力和蛋白含量。重复以上操作使硫酸铵饱和度分别达到30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，收集不同饱和度的上清液和沉淀。

1.3.3 DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换柱层析 将1.3.2 中得到的沉淀溶解液，在0～4 ℃下，用50 mmol/L 的Tris-HCl 缓冲液（pH 7.0）透析12 h，使用AKTA（FPLC）蛋白纯化系统，进一步通过DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析[17]，采用梯度洗脱的方法，纯化酶蛋白。试验缓冲体系为pH 7.0 的50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液；洗脱液为0～1.0 mol/L 的NaCl 溶液；设流速为1 mL/min；每管收集洗脱液1 mL，检测每管洗脱液中葡萄糖氧化酶活力和蛋白质含量，绘制洗脱图谱。

1.3.4 Sephacryl S-200 凝胶过滤层析 参考张茜等[10]的方法，用Tris-HCI 缓冲液（50 mmol/L，pH 7.0）平衡管路，至流出液恒定在pH 7.0，上样后设样品流速为0.5 mL/min。以相同缓冲液洗脱，设定自动部分收集为流速0.2 mL/min，每管收集0.5 mL。检测每管中葡萄糖氧化酶活力和蛋白质含量。

1.4 SDS-PAGE 鉴定酶的纯度及测定分子质量

聚丙烯酰胺凝胶电泳参照LaemmLi[18]的方法。在分离胶和浓缩胶浓度为12.5%和4.5%的条件下进行电泳，电泳后的凝胶用考马斯亮兰染色20 min，然后用脱色液脱色2～3 次后，在水平摇床脱色过夜。将纯酶与中分子质量标准蛋白在同一条件下进行SDS-PAGE，分析目的蛋白的亚基分子质量。

1.5 酶的性质测定

1.5.1 最适pH 值和pH 值稳定性 最适pH 值的测定：采用3 种不同缓冲体系配制pH 值为3.0～9.0，浓度0.05 mol/L 的缓冲液，如表1所示。经测定得到比较合适的范围以后，缩小缓冲液pH 范围以及间隔，最终得到最适pH 值。

表1 缓冲体系设计Table1 Designs of buffer system

pH 值稳定性的测定：将不同pH 值的缓冲液与GOD 纯酶等量混合，在30 ℃下分别保存24 h和72 h 后，冰水浴冷却30 min，再用标准方法测定葡萄糖氧化酶的剩余酶活力，未经处理的酶液为100%，计算残余酶活力。

1.5.2 最适温度和温度稳定性 最适温度的测定：用最适缓冲液将酶液适当稀释，分别在20～80℃下准确反应5 min，测定葡萄糖氧化酶活力，以酶活力最大值为100%。

温度稳定性的测定：在最适缓冲液中，将酶液在不同温度下分别保存0～5 h 后（每小时取样）按标准方法测定葡萄糖氧化酶的残余酶活力，以0 h 的酶活力作为100%。

1.5.3 金属离子对酶活力的影响 按照标准酶活力测定方法，考察不同浓度（1，3，5，7 mmol/L）不同种类金属离子对葡萄糖氧化酶活力的影响，以不添加金属离子的试验组作为对照。金属离子包括：Na+、K+、Li+、Mn2+、Pb2+、Mg2+、Ba2+、Zn2+、Al3+、Co2+、Fe3+、Ag+。

1.5.4 酶反应动力学参数的测定 在不同的葡萄糖 浓 度（25，50，75，100，150，200 mmol/L）下 测 定葡萄糖氧化酶的活力，以葡萄糖浓度的倒数1/S为横坐标，以酶活力倒数1/V 为纵坐标，采用Lineweaver-Burk 法[18]作图，从而求得该葡萄糖氧化酶的Km及Vmax。

1.6 酶对馒头品质的改良

1.6.1 馒头蒸制方法 基本配方（质量分数，%）：面粉：100，干酵母：0.5，水：55。

工艺流程：用40 ℃温水活化干酵母3 min，首先将面粉加入搅面机中，然后将酵母溶液、剩余水和酶（0，0.8，1.6，2.5，3.75，5 mg/kg 面粉）加入搅面机，和面20 min 后，将和好的面团盖一层湿布常温下放置10 min。然后手揉面团10 min，将揉好的面团分成100 g 的小面团，搓制成圆柱状馒头坯，在38 ℃、 相对湿度75%的条件下醒发45 min，醒发完成后将馒头坯蒸制20 min。蒸好的馒头在室温（15～20 ℃）冷却1 h 后，分别测定各指标。

1.6.2 馒头品质评定 质量：电子天平测定。

体积：采用油菜籽置换法测定。

比容和延展率：在样品的不同位置分别测量宽度和高度4 次，取平均值。比容为馒头体积与质量之比 （cm3/g），延展率为馒头宽度与高度之比（mm/mm）。

硬度测定：用刀将馒头从中间部分切开，左右各切出厚度为15 mm 的馒头片，4 个馒头可切出8个测试用的馒头片。硬度用Brookfield 质构仪测得，探头直径6 mm，TPA 测试条件：预测试速度为1 mm/s，测试速度为1 mm/s，后测速度为1 mm/s，引发力为5 g，压缩距离为50%。

馒头颜色的测定：采用色度仪测定馒头皮及馒头芯剖面的L（亮或白）、a（红色和绿色）和b（黄色和蓝色）。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖氧化酶的分离纯化

粗酶液经过浓缩，结果见表2，经硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析以及Sephacryl S-200 凝胶过滤层析曲线如图1、2、3所示，酶的分离纯化结果见表3。从整个分离过程来看，分离效果好，纯化倍数高。

表2 聚乙二醇浓缩结果Table2 The results of PEG enrichment

图1 不同硫酸铵饱和度下的上清液酶活力及蛋白含量的变化曲线Fig.1 Effect of ammonium sulphate content on the GOD activity and the protein content of filtrate after precipitation

图2 DEAE Sepharose Fast Flow 离子交换柱层析Fig.2 DEAE Sepharose Fast Flow ion exchange chromatography

图3 SephacrylS-200 凝胶过滤层析Fig.3 SephacrylS-200 gel filtration chromatography

表3 黑曲霉1504 产葡萄糖氧化酶的纯化总结Table3 Summary of GOD purification from 1504

2.2 SDS-PAGE 鉴定酶的纯度及测定分子质量

采用SDS-PAGE 法检测葡萄糖氧化酶的纯化过程及纯度，图4为黑曲霉菌株1504 所产葡萄糖氧化酶提纯步骤得到的电泳图，从图中可以看出最终得到的葡萄糖氧化酶蛋白在SDS-PAGE 凝胶上呈现单一条带，说明该葡萄糖氧化酶达到了电泳纯，分析得到该葡萄糖氧化酶的亚基分子质量为75.2 ku，然后经Sephacryl S-100 凝胶过滤层析测得该酶的分子质量为150.4 ku，由此证明黑曲霉菌株1504 所产葡萄糖氧化酶为双亚基分子。

图4 黑曲霉菌株1504 所产葡萄糖氧化酶纯化过程的电泳图Fig.4 SDS-PAGE of purified GOD from 1504

2.3 酶的性质鉴定

2.3.1 最适pH 值和pH 稳定性 由图5可知，黑曲酶1504 菌株发酵得到的葡萄糖氧化酶纯酶最适反应条件为偏酸性，在pH 5.5～7 之间，随着pH值的增加，葡萄糖氧化酶活力显著下降，说明碱性条件不利于该酶反应，这与黑曲霉H1-9b 所产葡萄糖氧化酶的性质相近[17]。进一步测定得到该葡萄糖氧化酶催化反应的最适pH 值条件为磷酸缓冲液pH 6.1。

由图6可知，将该酶在不同pH 值下保存24 h 和72 h，酶活力的损失趋势一致，保存24 h 时，在pH 5.5～7 范围内，得到的残余酶活力均大于90%，而在pH 4.5～8 范围内残余酶活力大于70%。保存72 h，酶液在pH 5～7 之间，残余酶活力大于70%。说明了黑曲霉1504 菌株所产葡萄糖氧化酶在pH 5～7 之间有较强的稳定性。

2.3.2 最适温度和温度稳定性 由图7可知，黑曲霉1504 所产葡萄糖氧化酶的最适反应温度为40 ℃。由图8可知，该酶在20～40 ℃条件下保存1～5 h，酶活力很稳定，处理5 h 后葡萄糖氧化酶残余酶活力仍在90%左右；在50 ℃下处理4 h，残余酶活力大于75%，处理5 h 后残余酶活力为63%。高于60 ℃处理1 h 酶活力损失严重，在70 ℃下处理2 h 后，酶活力几乎全部丧失。

图5 pH 值对葡萄糖氧化酶活力的影响Fig.5 Effect of pH on activity of purified GOD from 1504

图6 葡萄糖氧化酶的pH 稳定性Fig.6 Effect of pH on the stability of GOD from 1504

图7 葡萄糖氧化酶的最适反应温度Fig.7 Optimal temperature of purified GOD from 1504

图8 葡萄糖氧化酶在不同温度下的稳定性Fig.8 Stability of purified GOD from 1504 at different temperatures

2.3.3 金属离子的影响 由图9可知，金属离子Na+、K+、Li+、Mg2+在1～7 mmol/L 的浓度范围内对于黑曲霉菌株1504 所产葡萄糖氧化酶的活力影响不大，金属离子Pb2+在1～7 mmol/L 的各个浓度下都对该酶活力有一定的促进作用。Mn2+、Zn2+、Al3+、Co2+、Ba2+等几种离子在1～7 mmol/L 浓度下对该葡萄糖氧化酶的活力都有一定的抑制作用。而在试验选择的所有离子中，Ag+对于酶液的葡萄糖氧化酶活性抑制最强，几乎完全抑制酶活性。这与大部分文献中研究得到的结果基本一致[14，17，20]。

图9 金属离子对葡萄糖氧化酶活力的影响Fig.9 Effect of metal ions the GOD from 1504

2.3.4 动力学参数 在不同的葡萄糖浓度 （25～200 mmol/L）下测定葡萄糖氧化酶活力，以葡萄糖浓度的倒数1/S 为横坐标，以酶活力倒数1/V 为纵坐标，采用Lineweaver-Burk 法作图，从而求得黑曲酶菌株1504 产葡萄糖氧化酶的Km为36.7 mmol/L，Vmax为20.83 μmol/（L·s）。

2.4 葡萄糖氧化酶对馒头品质的改良

2.4.1 葡萄糖氧化酶对馒头体积的影响 从图10 中可以清楚的看到随着加酶量的增加，馒头体积随之增大，当加酶量为2.5 mg/kg 时，馒头的体积最大为268.7 mL，加酶量继续增大，馒头体积反而有减小的趋势，因此最适加酶量为2.5 mg/kg。Rasiah[21]、谢洁[22]等在试验中也发现，适当添加葡萄糖氧化酶可以有效增大面包的烘焙体积。

2.4.2 葡萄糖氧化酶对馒头比容和延展率的影响葡萄糖氧化酶添加量对馒头比容和延展率的影响趋势类似，都是随加酶量的增加先增大后减小。GOD 添加量为2.5 mg/kg 时，馒头比容和延展率最大（与对照相比分别提高了13.7%和6.5%）。加酶量大于2.5 mg/kg 时，馒头的比容和延展率反而下降，在0.8～3.75 mg/kg 试验范围内，比容和延展率仍高于空白组。试验中，葡萄糖氧化酶的最佳添加量为2.5 mg/kg，此时的馒头与对照组以及其它加酶量的馒头相比，体积、比容和延展率最大，馒头芯组织结构更加蓬松。

2.4.3 葡萄糖氧化酶对馒头硬度的影响 葡萄糖氧化酶添加到面粉中，对馒头硬度有很大改善效果，试验结果见图12。从图12 中可知，对照组馒头硬度为768.55 g，随着葡萄糖氧化酶添加量的增加，在0.8～2.5 mg/kg 范围内，馒头的硬度迅速下降，加酶量为2.5 mg/kg 时，馒头最为松软，硬度下降315.78 g，仅为空白对照的41.1%；继续增加葡萄糖氧化酶的添加量时，馒头硬度反而开始增加，然而试验所选加酶量的馒头硬度均低于空白对照组。国外研究者Caballero 等[23]发现添加一定量的GOD 可以降低面包的硬度，而效果不如试验中GOD 对面头硬度的影响明显，只降低为对照组的87.5%。林金剑等[24]对于葡萄糖氧化酶改善多谷物馒头硬度的研究发现，GOD 也可以改善馒头的硬度，可是改善效果与本研究相比程度较低。综上说明，不同来源菌株所产葡萄糖氧化酶都可改善面制品硬度，而效果因菌株来源不同而有所差异。

图10 葡萄糖氧化酶添加量对馒头体积的影响Fig.10 Effect of GOD on Chinese steamed bread volume

图11 葡萄糖氧化酶添加量对馒头比容和延展率的影响Fig.11 Effect of glucose oxygenase addition on specific volume and durability of steamed bread

图12 葡萄糖氧化酶添加量对馒头芯硬度的影响Fig.12 Effect of GOD on the firmness of Chinese steamed bread

2.4.4 葡萄糖氧化酶对馒头色度的影响 对色度的研究发现，添加葡萄糖氧化酶后馒头皮的白度略有增长，增长程度并不明显，对馒头芯表面色度的影响也有相同趋势，均在加酶量为1.6 mg/kg 时色度最白，继续增大葡萄糖氧化酶添加量，馒头白度逐渐下降且不稳定。总体来说，GOD 的添加对于馒头的白度影响不大。张芳芳[25]、方晓波[26]等专门研究了酶制剂对馒头色度的影响，其结果表明葡萄糖氧化酶对馒头色度有一定的改善作用。

综上，选择葡萄糖氧化酶改善馒头品质的最适加酶量2.5 mg/kg，在此条件下馒头的体积、比容、延伸率及硬度均最佳。

表4 葡萄糖氧化酶对馒头色度的影响Table4 Effect of GOD on the color of Chinese steamed bread

3 结论

对黑曲霉菌株液体发酵得到的葡萄糖氧化酶粗酶液经PEG 20000 浓缩、 硫酸铵盐析、DEAE Sepharose Fast Flow 离子交换层析和SephacrylS-200 凝胶过滤层析得到电泳纯的葡萄糖氧化酶蛋白带。整个纯化过程酶活回收率为27.07%，纯化倍数为51.13。经凝胶过滤层析测得酶的分子质量为150.2 ku，SDS-PAGE 法测定该酶的亚基分子质量为75.1 ku，证明该葡萄糖氧化酶为双亚基分子。黑曲霉葡萄糖氧化酶在pH 6.1 的磷酸缓冲体系下酶活力最高，在30 ℃时，该酶在pH 4.5～8.0范围内处理24 h 比较稳定，残余酶活力大于70%。该酶最适反应温度为40 ℃，在50 ℃下处理4 h，残余酶活大于75%，处理5 h 后残余酶活力为63%，因此该酶具有较好的热稳定性。在金属离子中，Pb2+对酶促反应的促进作用最强，Ag+对酶促反应的抑制作用最强。利用双倒数作图法求得黑曲霉菌株1504 产葡萄糖氧化酶的Km为36.7 mmol/L，Vmax为20.83 μmol/（L·s）。将经过研究的葡萄糖氧化酶添加到馒头中，当加酶量为2.5 mg/kg 时，馒头外观质量最佳，体积、比容和延展率也均为最大。添加0.8～2.5 mg/kg 的葡萄糖氧化酶，能明显降低馒头的硬度，最佳加酶量为2.5 mg/kg，此时馒头硬度最弱，仅为对照组的41.1%。而对馒头色度的研究发现，添加葡萄糖氧化酶后对馒头皮和馒头芯的白度有轻微改善作用，效果不明显。