两种骨诱导材料修复兔股骨髁缺损的实验研究

郭睿洲 赵彦涛 李利 胡先同

作者单位：100039 北京，解放军医学院 ( 郭睿洲 )；100048 北京，解放军总医院第四医学中心 ( 郭睿洲、赵彦涛，李利 )；100048 北京，骨科植入医疗器械工程技术研究中心 ( 胡先同 )

自体骨移植因其具有骨诱导、骨传导和成骨能力而成为金标准[1-3]，但是自体骨存在供区疼痛和局部并发症如血肿、骨折的潜在发生及数量有限等缺点[4]。长期以来异体移植物因其优异的成骨性能和骨传导性能被用作天然替代物覆盖骨缺损[5]，而异体骨也存在如传播疾病、排斥反应、骨不愈合、移植物吸收、自体骨骨折及供体缺乏等缺点[1,4]。与自体骨和异体骨相比，异种骨亦具备成骨和骨诱导性能，且来源充足，安全可靠。目前的异种骨主要分为煅烧骨、脱钙骨、冻干骨、冷冻骨，研究较多的主要为煅烧骨和脱钙骨。煅烧骨的性能与矿物相类似，其骨传导能力和生物相容性较好，但不具备骨诱导性能。它可与 BMP-2 等生长因子结合，用于脊柱融合及骨缺损修复[6]。脱钙骨基质 ( decalcified bone matrix，DBM ) 通常采用盐酸进行脱钙，导致矿物质成分丢失，但 I 型胶原、非胶原蛋白和骨诱导生长因子仍保存下来，包括不同浓度的骨形态发生蛋白 ( bone morphogenetic proteins，BMPs )、生长分化因子和转化生长因子 ( transforming growth factor，TGF-β1、TGF-β2 和 TGF-β3 )，从而具有骨传导性和骨诱导性[7]。脱矿质过程使细胞外基质中多种生长因子暴露出来，从而使有效的生物活性分子在宿主环境中发挥作用，脱钙后释放的 BMPs 可使干细胞向成骨分化，从而帮助骨愈合。但 DBM 力学性能较差，骨传导能力较弱，且可能由于处理过程较复杂仍具有一定的生物毒性。由于脱钙骨本身含有一定浓度的 BMP-2，具有骨诱导活性，但其与复合BMP-2 的煅烧骨相比，何者早期成骨效果更好并不明确，因此本实验拟对这两种骨诱导材料的早期成骨性能进行探讨。

材料与方法

一、脱钙骨及煅烧骨的制备

取成牛股骨髁经 -70 ℃ 冷冻后，用切割机切成5 mm×5 mm×5 mm 的骨块后分为两部分，一部分经马弗炉 700 ℃ 煅烧，另一部分先经过高压水枪冲洗，冲洗后使用 triton 1% 超声清洗 30 min，超声清洗后采用甲醇 / 氯仿 ( 1∶1 ) 进行脱脂，脱脂完成后采用 0.5 mol / ml 盐酸进行脱钙。加入 1∶3000 胃蛋白酶超声 30 min 混匀，摇床反应 8 h。30 U / ml 半乳糖苷酶，超声 30 min 混匀，摇床反应 8 h。50 U / ml DNA 酶超声 30 min 混匀，摇床反应 12 h，每次进行下一步工序前均采用纯化水对骨块进行冲洗，每次10 min，一共 3 次，超声清洗过程中保持水温不超过 37 ℃。酶处理后 75% 酒精没过骨块，摇床 100 r /min，持续 15 min，结束后放入冻干机冻干。

二、煅烧骨及脱钙骨打粉

煅烧骨及脱钙骨制备完成后分别进行研磨打粉处理，操作前先将骨块浸入液氮防止打粉过程中温度过高，打粉后将骨粉过筛网，筛选出粒径 270～1000 μm 骨粉备用，脱钙骨打粉完成后进行密封包装，60钴辐照灭菌。

三、煅烧骨复合 BMP-2

取 BMP-2 ( 北京睿泉生物技术公司提供 ) 与制备好的煅烧骨进行复合，加入浓度为 0.5 mg / g，加入适量 PBS 使液面没过骨块，充分震荡混匀，-20 ℃预冻 30 min 后，放入冻干机进行冻干，持续12 h 后进行密封包装，60钴辐照灭菌。

四、动物模型的制作与分组

选用 7 只雄性新西兰兔 ( 解放军总医院第四医学中心动物实验室提供 )，并分为三组：A 组为煅烧骨 / BMP-2，B 组为单纯脱钙骨基质组，C 组为空白组。其中 A、B 组各 3 只，C 组 1 只。取速眠新 1.5 ml 与氯胺酮 1 ml 进行混合，混匀后 0.2 ml / kg耳缘静脉注射麻醉，膝关节区域常规备皮、消毒、铺巾，取髌骨外侧纵行切口，长约 5 cm，逐层切开皮肤和肌肉，显露股骨外侧髁，取高速磨钻钻取直径 4 mm，深度 10 mm 的圆柱形缺损，钻孔过程中持续注入生理盐水控温。用镊子夹取缺损骨旋转后去除，在股骨外侧髁缺损区域分别填入煅烧骨 /BMP-2、DBM，空白组不填入材料 ( 图 1 )。逐层缝合伤口，术后正常饮食进水，术后前 3 天每天肌注青霉素 10 万 U。

五、观察指标

1. 植入后大体形态观察：在第 4 周时处死 7 只新西兰兔，将股骨内外侧髁至股骨干近端约 5 mm 处均完整取下，进行大体形态观察。

2. 组织学观察：股骨髁完整取下后使用 50%甲酸进行脱钙，1 周后每天用细针头在股骨干区域针刺，针头透过股骨干至对侧基本无阻力时视为脱钙完全，脱钙后放入脱水机进行脱水，随后石蜡包埋、切片至 0.5 μm 厚度进行 HE 染色。

结 果

一、大体形态及组织学观察

大体观察显示，煅烧骨 / BMP-2 材料完全覆盖缺损区域，与周围骨组织连结紧密，以细针头针刺骨缺损区域无法穿透，缺损区域骨化面积约 75%～100%；单纯 DBM 材料未能完全覆盖骨缺损区域，材料与骨组织结合欠佳，边缘尚留有空隙，以细针头针刺骨缺损区域，部分区域可以穿透，骨化面积约 50%～75% ( 图 2 )。

组织切片行苏木精-伊红染色后可见煅烧骨 /BMP-2 材料填充于直径 0.4 cm 的圆形缺损区域内，材料周围均有大量新骨形成，材料与新生骨交织成片覆盖整个缺损区域，可见大量的骨陷窝和骨细胞，亦可见部分骨小梁形成，未见炎症细胞及新的血管形成。而单纯 DBM 组可见大量成片的 DBM 将缺损中央区域填满，仅在部分材料的边缘区域见到少量成条索状的新骨形成，材料与宿主骨之间及宿主骨周围由纤维性组织填充，骨陷窝和骨细胞数量较少，未见新的骨小梁形成及新生血管 ( 图 3 )。通过 imagepro-plus 6.0 软件定量计算新生骨 ( 玫红色 )的面积及新生骨占整个缺损区域的百分比 ( 表 1 )。

表1 兔股骨髁缺损中各组植入材料及新生骨面积的比较 (±s，n = 3 )Tab.1 Comparison of implant materials and new bone area in rabbit femoral condyle defects ( ±s, n = 3 )

表1 兔股骨髁缺损中各组植入材料及新生骨面积的比较 (±s，n = 3 )Tab.1 Comparison of implant materials and new bone area in rabbit femoral condyle defects ( ±s, n = 3 )

注：煅烧骨 / BMP-2 组与脱钙骨基质组的新生骨面积比较，差异有统计学意义，aP ＜ 0.05Notice: Differences of new bone area between calcined bone / BMP-2 group and decalcified bone matrix group were significant, aP ＜ 0.05

项目 锻烧骨 / BMP-2 DBM新生骨面积 ( cm2 ) 0.0210±0.007a 0.0021±0.002材料面积 ( cm2 ) 0.0308±0.011 0.0337±0.025新生骨 / 缺损区域 0.1675±0.600a 0.0173±0.017

图1 兔股骨髁缺损模型的建立及材料植入 a：外径 4 mm 电钻钻孔；b：股骨髁 4 mm 缺损；c：植入缺损区域的煅烧骨 / BMP-2Fig.1 Establishment of rabbit femoral condyle defect model and material implantation a: Drilling with an electric drill of an outer diameter 4 mm;b: Femoral condyle 4 mm defects; c: Calcined bone / BMP-2 implanted in the defect area

讨 论

DBM 是一种有吸引力的用来替代自体骨移植的材料，其具备的骨传导性和骨诱导性可以帮助促进骨愈合。脱钙引起矿化基质内以 BMP-2 为主的骨诱导生长因子暴露在表面，可以增强骨形成过程[8]。BMPs 是有效的骨诱导生长因子，在多种动物模型中已经证明了其加速骨形成的效果显著[9-10]。DBM 作为一种骨诱导材料，我们推测它可以通过 BMP-2 发挥较好的成骨效果。但是现有的临床研究表明，关于 DBM 有效性的证据水平仍然较低[11]。关于 DBM的有效性和骨诱导潜力存在争议，一些研究表明DBM 在骨再生和骨质矿化中效率低下[12]。几项动物实验表明，单独使用 DBM 可能不足以完全修复骨缺损[12-14]。几项临床前研究亦证实在临界骨缺损中使用 DBM 后仍然缺乏骨再生[12,15-16]。对此，有可能的原因是不同的 DBM 产品中 BMP-2 的量存在差异，从而骨诱导能力有限。本研究中 DBM 组的成骨能力欠缺，有可能是由于制备过程中 BMP-2 部分丢失，而残余的 BMP-2 未能达到最小治疗剂量所致。另一方面，与煅烧骨相比，DBM 的主要成分中缺少羟基磷灰石等矿物质成分，研究推测尽管 DBM 具备骨诱导活性，但可能并不是最适合 BMP-2 的载体形式。

图2 大体形态观察 a：缺损区域填入煅烧骨 / BMP-2；b：缺损区域填入 DBMFig.2 Gross morphology observation a: The defect area filled with calcined bone / BMP-2; b: The defect area filled with DBM

煅烧骨主要成分为羟基磷灰石，具有良好的生物相容性和骨传导性能，几乎没有生物毒性。尽管其缺乏骨诱导性，但其骨传导能力明显优于 DBM，且具有与骨发生化学键结合的能力[17]。多项研究已经证实，煅烧骨在与 BMP-2 复合后可以解决其骨诱导能力缺乏的问题。Wu 等[18]通过体外研究阐明 BMP-2 ( rhBMP-2 ) 在与 hAMSCs 复合后添加在nHAC / PLA 上的作用，HAMSCs 出现了理想的成骨细胞 ( OB ) 分化能力并且 BMP-2 ( rhBMP-2 ) 有利于hAMSCs 的增殖和成骨。本实验结果亦证实煅烧骨在与 BMP-2 复合后，不仅有了一定的骨诱导能力，且生物相容性和骨传导能力均较好，是用于骨缺损修复的理想材料。本实验采用的动物模型为兔股骨髁缺损模型，股骨髁作为负重骨，对机械稳定性有着较高的要求，从本实验大体观察的结果来看，煅烧骨 / BMP-2 组骨与材料的连接性要优于 DBM 组，骨化面积几乎覆盖整个缺损，而 DBM 材料与缺损之间仍留有缝隙。从组织学染色结果来看，煅烧骨在与BMP-2 复合后骨缺损部位的新生骨亦明显多于 DBM组。对于这两种材料的描述仅为半定量和定性的评价，缺乏绝对定量的指标，两种材料在早期成骨方面影响究竟有多大的差异仍有待进一步的研究。

DBM 及煅烧骨 / BMP-2 均能在一定程度上促进早期成骨。而尽管 DBM 本身即含有少量 BMP-2，其成骨能力比之煅烧骨 / BMP-2 仍较弱。

图3 植入材料后各组股骨髁缺损区域苏木精 - 伊红染色 a：煅烧骨 / BMP-2 ( 4 × )；b：煅烧骨 / BMP-2 ( 10 × )；c：DBM ( 4 × )；d：DBM ( 10 × )；e：空白组 ( 4 × )；f：空白组 ( 10 × )Fig.3 Hematoxylin-eosin staining in the femoral condyle defect area after implantation of materials a: Calcined bone / BMP-2 ( 4 × ); b: Calcined bone / BMP-2 ( 10 × ); c: DBM ( 4 × ); d: DBM ( 10 × ); e: Blank group ( 4 × ); f: Blank group ( 10 × )