清肺消炎丸对不可分型流感嗜血杆菌诱导肺部炎症小鼠的影响

黄家望，陈平安，廖 灿，袁 娉，谢 希，孟亚飞，付涵煦，曲 磊，刘 淑∗

（1.湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学医学院，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学中医学院，湖南 长沙 410208；4.天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂，天津 300457）

流感嗜血杆菌可分为荚膜型和无荚膜型，后者因不能与已知的荚膜多糖抗血清发生凝集反应，又被称为不可分型流感嗜血杆菌，它是引起慢性阻塞性肺疾病急性加重的最重要病原菌之一［1］，寄居于上皮细胞和巨噬细胞，借助该生存方式［2］而逃避了局部免疫应答，得以在呼吸道中持续存在，从而与宿主免疫力之间维持一种动态平衡，当宿主免疫力下降时则大量繁殖，引起感染，严重时可危及患者生命，目前国内外尚无相关疫苗［3-5］。TLR4通路被证实为介导不可分型流感嗜血杆菌诱发免疫反应的重要途径［6］，与炎症免疫机制密切相关［7-8］。

天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂研制的清肺消炎丸由麻黄、地龙、葶苈子、炒苦杏仁、石膏、牛蒡子、人工牛黄、羚羊角八味药组成，对流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球杆菌等有较显著的抑制作用，而由不可分型流感嗜血杆菌诱导的肺炎临床表现为发热、寒战、咳嗽、胸闷，与清肺消炎丸主治症状相吻合，可为该制剂相关治疗提供理论依据。因此，本实验以不可分型流感嗜血杆菌感染的小鼠为研究对象，探讨清肺消炎丸是否通过调控TLR4 介导的信号通路来干预其诱导的肺部炎症，为相关临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器 台式高速冷冻离心机（美国Thermo 公司）；YJ-875A 净化工作台（吴江市宇鑫净化技术设备有限公司）；超微量分光光度计（德国Implen公司）；实时定量 PCR 仪、电泳仪、垂直电泳槽、电转槽、ChemiDoc XRS ＋化学发光成像分析系统（美国 Bio-Rad 公司）；微量移液器（德国Eppendorf 公司）；A0820 石蜡切片机（美国 AO 公司）；WD-9405B 水平摇床（北京六一仪器厂）；Synergy2 多功能酶标仪（美国Bio-Tek 公司）。

1.2 试剂 不可分型流感嗜血杆菌购自上海复祥生物科技有限公司，批号ATCC49247。小鼠IL-1β（批号 ab100704）、IL-6（批号 ab100712）、GCSF（批号 ab197743）、TNF-α（批号 ab100747）ELISIA 检测试剂盒（英国 Abcam 公司）；Trizol（美国 Invitrogen 公司）；逆转录试剂盒（批号A3500）、qPCR mix（批号 A6001）（美国 Promega公司）；TLR4、MyD88、TRAF6、β-actin 引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］；RIPA 蛋白裂解液（批号CW2334S）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号CW0014S）、SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒（批号CW0022）（北京康为世纪生物科技有限公司）；Fermentas 彩色预染蛋白Marker（北京优尼康生物科技有限公司）；ECL 发光检测试剂盒（批号35055，美国 Thermo Fisher 公司）；TLR4 抗体（批号 ab13556）、MyD88（批号 ab2064）、TRAF6（批号 ab62488）、β-actin（批号 ab8227）（英国 Abcam公司）；HRP 标记的羊抗鼠二抗（批号 SA00001-1）、羊抗兔二抗（批号 SA00001-2）（美国 Proteintech 公司）。

1.3 动物 6～8 周 C57 小鼠 50 只，体质量（20±2）g，雌雄各半，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物质量合格证号 SYXK（湘）2013-0005。

1.4 药物 清肺消炎丸购自天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂（批号9000081），氨苄西林（珠海联邦制药股份有限公司，批号70910804）、麻杏石甘汤（麻黄 9 g、苦杏仁 9 g、石膏18 g、炙甘草6 g）购自湖南中医药大学第一附属医院。按动物体表面积剂量换算法，双蒸馏水制备小鼠临床等效剂量的各药物水溶液，见表1。

表1 各药物临床剂量Tab.1 Clinical dosages of various drugs

2 方法

2.1 造模、分组及给药 参考文献［9］方法制备不可分型流感嗜血杆菌琼脂珠悬液，10%水合氯醛腹腔麻醉小鼠后作颈部正中切口暴露气管，将琼脂珠悬液接种于肺部（2×105CFU），将其注入小鼠气管后在注入 100 μL 空气，直立 10 s，使琼脂珠悬液流入肺部，空白组滴鼻等量生理盐水。第2天，再将40 只感染小鼠根据随机数字表分为模型组、氨苄西林组、麻杏石甘汤组、清肺消炎丸组，每组 10 只，分笼饲养，自由饮水摄食。见表2。

2.2 指标检测

2.2.1 一般情况 最后1 次给药后小鼠禁水禁食8 h，记录小鼠体质量，分离胸腺、脾脏、肺脏并称定质重［9］。

2.2.2 血清炎性细胞因子水平检测 实验结束时处死小鼠，迅速摘除眼球取血，2 500 r／min 离心10 min，分离上层血清，根据ELISA 试剂盒说明书进行操作，检测血清 IL-1β、IL-6、GCSF、TNF-α水平。

2.2.3 肺组织病理变化观察 取小鼠左上叶肺病变区肺组织，10%中性甲醛固定，梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片（厚度 5 μm），HE 染色，脱水，透明，封片，光学显微镜下观察肺组织病理变化。

2.2.4 肺组织 TLR4、MyD88、TRAF6 蛋白表达检测 采用Westren-blot 法。取小鼠右下叶肺组织，于液氮中研磨至粉末状，提取组织总蛋白质，BCA法测定蛋白量，取 50 μg 总蛋白上样，SDS-PAGE电泳，转膜后封闭处理 1 h，加入一抗 TLR4、MyD88、TRAF6 兔抗鼠多克隆抗体（1 ∶1 000），孵育过夜，二抗（1 ∶3 000）室温下孵育 1 h，暗室加ECL 化学发光剂后于化学发光仪中成像，IPP6.0 图像分析软件进行信号分析，计算目的蛋白／β-actin 蛋白比值。

2.2.5 肺组织 TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA 表达检测 采用 RT-PCR 法。取右上叶肺组织，Trizol法提取总RNA，超微量紫外分光光度计检测浓度后将1 μg 总RNA 逆转录合成cDNA，以其为模板，荧光定量PCR 试剂盒进行扩增，操作均按相应试剂盒说明书进行。qPCR 反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性 10 s，60 ℃ 退火延伸 30 s，循环40 次，以 β-actin 为 内 参，2-ΔΔCt法 计 算 TLR4、MyD88、TRAF6 相对表达，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表3。

表3 引物序列Tab.3 Primer sequences

2.3 统计学处理 通过SPSS 19.0 软件进行处理，计量资料以（）表示，先对数据进行方差齐性检验，方差齐时用 One-Way ANOVA 检验，并用LSD 法进行组间多重比较，而方差不齐时用非参数秩和检验，先用Kruskal-Wallis H 检验比较总差异，再用Mann-Whitney U 检验进行2 组间比较；计数资料以百分率表示，采用完全随机设计多样本比较的秩和检验。

3 结果

3.1 清肺消炎丸对小鼠一般情况的影响 图1显示，空白组小鼠精神良好，毛发有光泽，活动、进食、呼吸正常，体质量自然增加；模型组小鼠耸毛、蜷缩、怕冷、毛发无光泽，呼吸加快、短促，食差、消瘦，与空白组比较，体质量、脾指数、胸腺指数显著下降（P＜0.01），肺指数显著升高（P＜0.01）；给药组均能不同程度改善小鼠一般情况，与模型组比较有显著差异（P＜0.01），效果依次为清肺消炎丸组＞氨苄西林组＞麻杏石甘汤组，但组间比较无显著差异（P＞0.05）。

3.2 清肺消炎丸对炎性细胞因子水平的影响 图2显示，与空白组比较，模型 组 IL-1β、IL-6、GCSF、TNF-α 水平显著升高（P＜0.01）；给药组四者水平不同程度下调，与模型组比较有显著差异（P＜0.01），效果依次为氨苄西林组＞清肺消炎丸组＞麻杏石甘汤组，但组间比较无显著差异（P＞0.05）。

3.3 清肺消炎丸对小鼠肺组织病理变化的影响 表4、图3～4显示，空白组小鼠肺支气管和肺泡结构完整，肺内未见炎症细胞浸润；模型组小鼠肺组织间质增生明显，肺泡隔增厚加重，肺泡扩张，肺内支气管上皮细胞脱落、炎性细胞浸润增多；给药组均能不同程度改善肺部间质增生现象及炎症渗出，与模型组比较有显著差异（P＜0.05），但组间比较无显著差异（P＞0.05）。

图1 清肺消炎丸对小鼠一般情况的影响Fig.1 Effects of Qingfei Xiaoyan Pills on mice general conditions

图2 清肺消炎丸对炎性细胞因子水平的影响Fig.2 Effects of Qingfei Xiaoyan Pills on inflammatory cytokine levels

表4 各组小鼠肺组织病变程度（n=10）Tab.4 Lesion degrees of mice lung tissue in various groups（n=10）

3.4 清肺消炎丸对 TLR4、MyD88、TRAF6 蛋白表达的影响 图5显示，与空白组比较，模型组TLR4、MyD88、TRAF6 蛋白表达显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，给药组三者蛋白表达显著升高（P＜0.01），效果依次为氨苄西林组＞清肺消炎丸组＞麻杏石甘汤组，但组间比较无显著差异（P＞0.05）。

图3 各组小鼠肺组织大体标本Fig.3 Gross specimens of mice lung tissue in various groups

图4 各组小鼠肺组织病理变化（HE，×200）Fig.4 Pathological changes of mice lung tissue in various groups（HE，×200）

图5 清肺消炎丸对TLR4、MyD88、TRAF6 蛋白表达的影响Fig.5 Effects of Qingfei Xiaoyan Pills on TLR4，MyD88 and TRAF6 protein expressions

3.5 清肺消炎丸对TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA表达的影响 图6显示，与空白组比较，模型组TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA 表达显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，给药组三者mRNA 表达显著升高（P＜0.01），效果依次为氨苄西林组＞清肺消炎丸组＞麻杏石甘汤组。

图6 清肺消炎丸对TLR4、 MyD88、 TRAF6 mRNA 表达的影响Fig.6 Effects of Qingfei Xiaoyan Pills on TLR4， MyD88 and TRAF6 mRNA expressions

4 讨论

不可分型流感嗜血杆菌侵入下呼吸道后的感染会释放细菌内毒素、纤毛毒素、蛋白水解酶等细菌产物，导致前炎症细胞因子释放，中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞在气道和肺实质的聚集和脱颗粒，诱导呼吸道黏膜上皮细胞释放前炎症细胞因子IL-8、IL-6、TNF-α、ICAM-1 表达，从而 引发 炎症，导致肺实质损伤和进行性小气道闭塞，甚至组织破坏和重构［10］。炎症反应的启动有赖于模式识别受体（PRRS）对病原体保守分子的识别［11］，可识别流感嗜血杆菌的 PRRS 主要为 Toll 样受体（TLR）［12-13］，其中 TLR4 是典型的模式识别受体，主要表达于单核-巨噬细胞表面，识别内外源性致炎因子，介导肺部炎症反应［14-15］。Wang 等［16］发现，LPS 可诱导活化巨噬细胞，激活 TLR4-MYD88-TRAF6 信号通路，诱导肺实质损伤，抑制该信号通路时可抑制LPS 诱导产生的肺实质损伤；Xu 等［17］报道，透明质酸可通过影响 TLR4-MyD88-NF-κB 信号通路来减轻LPS 诱发急性肺损伤小鼠肺组织的炎症反应和病理损害；本实验证实TLR4在不可分型流感嗜血杆菌诱导小鼠肺部炎症的发病机制中有着重要作用，其机制可能是TLR4 通过直接或间接识别不可分型流感嗜血杆菌，启动MyD88 依赖的信号通路，激活肿瘤坏死因子受体相关蛋白 6（TKAF6），进而引起 TNF-a、IL-Iβ、IL-6 等促炎因子介导机体抗细菌免疫应答，引起一系列炎症反应，这也提示药物若能在早期干预，可通过有效阻止不可分型流感嗜血杆菌诱导的TLR4-MyD88-TRAF6 信号通路激活来避免或减轻肺部损伤。

清肺消炎丸以 《伤寒论》 中麻杏石甘汤为基础，保留主要药材麻黄、石膏、苦杏仁，增加地龙、牛蒡子、葶苈子、人工牛黄、羚羊角，方中麻黄辛温，宣肺平喘，是为君药；石膏辛甘大寒，清泻肺火；地龙清热平喘，共为臣药；苦杏仁甘大寒，止咳平喘；葶苈子泻肺平喘；牛蒡子解毒利咽；牛黄、羚羊角清热豁痰、凉肝熄风，共为佐药。该制剂既能宣通，又清内热，还有化痰、止咳、平喘的功效［18］，现代研究表明［19］它具有止咳平喘、清肺化痰的功效，还可降低炎症因子表达，减少肺部细胞因子、炎细胞浸润，改善肺部组织坏死脱落，具有较好的抗炎效果。

本实验发现，清肺消炎丸能显著下调血清炎性细胞因子 IL-1β、IL-6、GCSF、TNF-α 水平及肺组织 TLR4、MYD88、TRAF6 蛋白、mRNA 表达，其机制可能是通过调控不可分型流感嗜血杆菌感染激活的TLR4-MYD88-TRAF6 信号通路，进而抑制炎性细胞因子分泌，最终改善小鼠肺组织损伤和炎症程度。但TLR4-MYD88-TRAF6 信号通路是否为不可分型流感嗜血杆菌诱导肺部炎症的唯一通路还需进一步研究，而清肺消炎丸药效成分复杂，作用靶点多样，其相关物质基础也需深入探索。