HPLC法测定西红花不同部位中西红花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ

王萌萌，徐步斌∗，周 斌∗，何天承

（1.江西科技师范大学药学院，江西 南昌 330013；2.贵溪市藏红花农林综合开发有限公司，江西 贵溪 335400）

西红花为鸢尾科植物番红花Crocus sativusL.的干燥柱头，又称番红花、泊夫兰［1］。西红花原产于西班牙、印度、希腊等地，目前在我国的西藏、河南、上海、江苏［2-3］等地已有种植。西红花的主要药用部位是柱头，但因其产量低且资源稀少，往往满足不了大众的需求［4-5］。西红花性味甘平，具有活血化瘀、凉血解毒、安神的功效，中医经常用于闭经、产后瘀阻、忧郁、惊悸等［6-8］。西红花中主要成分有黄酮、苷类及挥发油类等，而西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ［9］是其主要有效成分。在药理学方面，西红花对心血管系统、动脉粥样硬化、高血压和糖尿病、抗肿瘤等［10-14］都有良好的治疗作用。本实验采用HPLC 法测定了江西产西红花柱头、雄蕊、花瓣、茎、球体中西红花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的含有量，并对其进行了比较，以期为进一步综合开发利用西红花资源提供参考，也为深入研究其质量奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1100 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；KQ-200VDE 型双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；CP225D 电子天平（十万分之一，瑞士Mettler Toledo 公司）。

1.2 试药 西红花苷-Ⅰ对照品（批号 B21337，含有量 ≥ 98%）、西红花苷-Ⅱ 对照品（批号B21338crocin-Ⅱ，含有量≥98%）（上海源叶生物科技有限公司）；甲醇为色谱纯，乙醇为分析纯（西陇化工股份有限公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

西红花的各个部位分别为柱头、雄蕊、花瓣、开花前和开花后的茎、球茎采自江西省贵溪市金屯乡，经江西中医药大学邓可众副教授鉴定为正品。将不同部位的药材分别于50 ℃条件下干燥3 h备用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 依利特 hypersil ODS2 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（50 ∶50）；检测波长 440 nm；体积流量 1.0 mL／min；进样量20 μL；柱温 25 ℃。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 对照品溶液制备 精密称定西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ对照品各 12.5 mg 置 25 mL 量瓶中，加50%乙醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ对照品贮备液，质量浓度为0.5 mg／mL。

2.3 供试品溶液制备 取适量干燥的西红花花瓣、雄蕊、柱头、开花前的茎和开花后的茎、球茎等样品于研钵中研成细粉，分别称取各样品（柱头除外）0.5 g，精密称定，置于 10 mL 锥形瓶中，精密加入10 mL 50%乙醇，称定质量。取柱头样品粉末 20 mg，精密称定，置于 100 mL 锥形瓶中，精密加入100 mL 50%乙醇，称定质量，各样品分别于室温条件下超声（200 W，40 kHz）处理30 min，放冷至室温，再称定质量，用50% 乙醇补足减失质量，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察 分别移取上述西红花苷混合对照品溶液 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL置于5 mL 棕色量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，在 “2.1”项色谱条件下测定峰面积。以西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归。得回归方程分别为Y= 127.28X- 78.649（R2=0.999 9）、Y= 135.46X-67.573（R2= 0.999 9），分别在 1.406～50.48、1.044～30.65 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 精密吸取 “2.2”项下混合对照品溶液20 μL，在 “2.1”项色谱条件下连续进样6 次。测得西红花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的峰面积RSD 分别为0.76%、0.90%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 精密称取西红花柱头粉末5 份，每份 20 mg，精密称定，按 “2.3”项下方法平行制备5 份供试品溶液，经过0.22 μm 微孔滤膜过滤后，在 “2.1”项色谱条件下进样 20 μL，测得西红花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的含有量 RSD 分别为 0.77%、0.90%，RSD 值均小于2%，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取同一批供试样品溶液适量，分别于 0、2、6、8、12、24 h 在 “2.1”项色谱条件下进样20 μL，测得西红花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ峰面积RSD 分别为1.60%、0.77%，表明该供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 取已知含有量的西红花柱头5 份，各10 mg，精密称定。分别精密加入西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ对照品溶液（500 μg／mL）2.4、1.2 mL，按 “2.3”项下方法制备供试品溶液，在 “2.1”色谱条件下进样 20 μL，计算其加样回收率，结果见表1。

表1 各成分加样回收率试验结果（n=5）Tab.1 Results of recovery tests for various constituents（ n=5）

2.9 样品含有量测定 精密称取3 份西红花柱头20 mg，花瓣、雄蕊、球茎、开花前的茎和开花后的茎等样品粉末，平行 3 份，每份0.5 g，精密称定，按 “2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”色谱条件下进样 20 μL，结果见表2。

3 讨论

本实验采用HPLC 法比较了西红花不同部位中西红花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的含有量，结果表明，西红花柱头中的含有量最高，总含有量为18.36%，符合2015版 《中国药典》 的规定，西红花中不同部位含有量高低的顺序为柱头＞雄蕊＞花瓣＞开花后的茎，而开花前的茎和球茎并未检测出。

表2 各成分含有量测定结果（%）Tab.2 Results of content determination of various constituents（% ）

在进行色谱条件优化时，按2015版 《中国药典》 中的色谱条件进行，由于出峰时间太长且峰形不美观，经过调整，确定甲醇-水（50 ∶50）的比例，缩短了出峰时间，且可以达到基线分离。

西红花苷是西红花中的主要活性成分之一，具有重要的药理作用。本实验采用HPLC 法对西红花中不同部位中的西红花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ含有量进行测定和比较，可以为其非传统药用部位或新药药用部位的开发利用提供实验支持，也为其各部位的质量控制评价奠定基础。