扶正救肺方提取工艺的优化

沈丹丹，顾志荣，马天翔，许爱霞，祁 梅，刘洁丽，葛 斌

［1.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州730000；2.甘肃省人民医院药剂科，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省中药质量与标准研究重点实验室 （培育基地），甘肃 兰州 730000］

特发性纤维化是弥漫性间质性肺病中的1种特殊类型，是1种不可逆纤维化、原因不明、发生于成人、局限于肺及进行性致纤维化的间质性肺炎［1］，其发病原因及分子机制目前仍不清楚，目前尚无确切的治疗手段［2］。该病死亡率高、预后差，明确诊断后中位生存期仅有 2～3年，5年生存率不足40%。中医认为特发性纤维化属 “肺痹”“肺痿”等范畴，属本虚标实之证，其病机在于机体气虚血瘀、痰瘀互阻、痰热蕴肺。

扶正救肺方主要药物构成为黄芪、炒白术、沙参、生地、麦冬、丹参、川芎、当归等 14 味，是甘肃省人民医院在中医理论指导下，以益气、健脾、活血为基本治法，结合临床实践拟定的治疗特发性纤维化的中药汤剂，目前已在临床应用十余年，并取得了较好的临床疗效，深受患者认可。研究表明，该方君药黄芪作用明确、安全可靠，据报道其主要有效成分黄芪甲苷及其皂苷元环黄芪醇、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪总皂苷等均有治疗特发性纤维化的作用［3-4］。川芎、当归作为本方的主要药物，其共有的主要有效成分阿魏酸能够降低肺过敏、炎症及黏液产生，有治疗特发性纤维化的潜在作用［5］。本研究以黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸得率及干浸膏提取率为指标，通过多指标加权综合评分考察加水倍量、提取次数及提取时间对扶正救肺方提取效果的影响，优选最佳提取工艺，为扶正救肺颗粒的开发研究提供基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100 LC／DAD 系统（包括G1312A 二元梯度洗脱泵、G1313A 进样器、G1315BDAD 检测器、G1316A 柱温箱和Agilent 化学工作站，美国 Agilent 公司）；ELSD-UM 3000 蒸发光散射检测器、十万分之一 Sartorius BT125D 精密电子天平（德国 Sartorius 公司）；SK 3300H 超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；DK-98-11A 电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；L-500 型台式低速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）。

1.2 试药 黄芪、当归、川芎、白术等14 味中药饮片购于甘肃陇脉药材有限公司，均经甘肃中医药大学中药鉴定教研室李硕副教授鉴定符合2015年版 《中国药典》 一部有关规定。对照品黄芪甲苷（批号110781-201616）、阿魏酸（批号 110773-201313）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号111920-201606），均购自于中国食品药品检定研究院。色谱纯乙腈（上海星可高纯溶剂有限公司，批号011360403）；色谱纯甲醇（天津北辰方正试剂厂，批号20170210）；色谱纯甲酸（天津大茂化学试剂厂，批号20161011）；分析纯甲醇（天津北辰方正试剂厂，批号20170717）；超纯水。

2 方法与结果

2.1 阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含有量测定

2.1.1 供试品溶液制备 精密量取30 mL 提取液，置包有遮光纸的具塞锥形瓶中，加入甲醇溶液50 mL，密塞，称定质量，超声提取（功率 90 W，频率 59 kHz）60 min，放冷，称定质量，甲醇补足减失质量，摇匀，3 000 r／min 离心5 min，取上清液，过滤，溶剂回收至干，以甲醇溶液充分溶解，定容至100 mL 量瓶中，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。

2.1.2 混合对照品溶液制备 分别精密称取阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，置于棕色量瓶中，加甲醇超声使完全溶解，定容至刻度线，制成阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度分别为0.025 2、0.0 158 mg／mL 的混合对照品溶液，于4 ℃下保存备用。

2.1.3 色谱条件 反相 Agilent Eclipse Plus-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈（A）-0.2% 甲酸（B）为流动相，梯度洗脱（0～10 min，8%～13% A；10～20 min，13%～20% A；20～40 min，20%～40% A；40～60 min，40%～55% A；60～70 min，55%～85% A；70～90 min，85%～100%A）；体积流量 1.0 mL／min；检测波长 260 nm（毛蕊异黄酮葡萄糖苷）、320 nm（阿魏酸）；柱温 30 ℃；进样体积10 μL。在上述色谱条件下，精密吸取混合对照品溶液及供试品溶液进样，结果表明2种成分的分离度均大于1.5，理论板数以阿魏酸峰计＞5 000。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.1.4 线性关系考察 分别精密量取 “2.1.2”项下混合对照品溶液 0.5、1、2、4、6、8、10 mL，置 10 mL 量瓶中，用甲醇逐级稀释成每 1 mL 分别含有阿魏酸 1.26、2.52、5.04、10.08、15.12、20.16、25.20 μg，每 1 mL 分别含有毛蕊异黄酮葡萄糖苷 0.79、1.58、3.16、6.32、9.48、12.64、15.80 μg 的系列对照品溶液，分别吸取10 μL在 “2.1.3”项条件下进样。以混合对照品质量浓度为横坐标（X），相应的峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷方程分别为Y=58.954 7X＋10.422 3（r= 0.999 7）、Y= 36.8172X- 2.9726（r=0.9997），分别在 1.26～25.20、0.79～5.80 μg／mL范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度、稳定性试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，在 “2.1.3”项色谱条件下连续进样 6 次，考察日内精密度，结果阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积RSD分别为 1.67%、1.56%。再精密吸取混合对照品溶液10 μL，在 “2.1.3”项色谱条件下每天进样 3 次，连续测定3 d，考察日间精密度，结果阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积RSD 分别为2.21%、1.48%，表明该仪器精密度良好，对照品溶液3 d 内稳定性良好。

2.1.6 重复性试验 按 “2.1.1”项下方法平行制备供试品溶液 6 份，分别精密吸取 10 μL，在 “2.1.3”项色谱条件下进样，测得阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含有量的RSD（n=6）分别为 2.76%、1.96%，表明该方法重复性良好。

2.1.7 加样回收率试验 分别精密吸取已测定的供试品溶液共 9 份，每 3 份为一组，按低、中、高 3 个水平精密加入混合对照品溶液适量，按 “2.1.1”项下方法制备供试品溶液，在 “2.1.3”项色谱条件下进样，测得阿魏酸平均加样回收率103.56%，RSD 3.23%；毛蕊异黄酮葡萄糖苷平均加样回收率102.43%，RSD 2.34%。

2.1.8 样品含有量测定 按 “2.1.1”项下方法制备供试品溶液，在 “2.1.3”项色谱条件下进样，以外标法计算含有量，结果见表2。

2.2 黄芪甲苷含有量测定

2.2.1 供试品溶液制备 本研究引用 《香港中药材标准》黄芪药材中黄芪甲苷的含有量测定方法制备供试品溶液［6-7］。精密量取提取液 30 mL，减压干燥 72 h，将浸膏粉置 50 mL 离心管中，加甲醇 30 mL，超声处理 30 min（功率 90 W、频率 59 kHz），3 000 r／min 离心 5 min，取上清液，离心所得残渣用甲醇洗涤 2 次，每次 15 mL，再超声处理 5 min（功率 90 W、频率59 kHz），3 000 r／min 离心5 min，过滤，合并 3 次滤液，用旋转蒸发仪减压蒸干，残渣用10%氨水溶液10 mL 重新溶解，放置10 min，不时振摇，将溶液移至分液漏斗中，用水饱和正丁醇溶液萃取3次（15、10、10 mL），合并萃取液，以旋转蒸发仪减压浓缩蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。进样前，用 0.45 μm 微孔滤膜过滤。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取黄芪甲苷对照品0.5 mg置于5 mL 量瓶中，如有未溶小颗粒可超声至完全溶解，加甲醇至刻度线，得到每1 mL 含黄芪甲苷0.1 mg 的对照品溶液。

2.2.3 色谱条件 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈-水；体积流量0.8 mL／min；柱温 25 ℃；进样量 20 μL。蒸发光散射检测器（ELSD）参数为漂移管温度40 ℃；雾化温度为40 ℃；氮气体积流量 1.5 L／min；增益为2。色谱图见图2。

图2 各样品HPLC-ELSD 色谱图

2.2.4 线性关系考察 精密吸取黄芪甲苷对照品贮备液，分别稀释成每 1 mL 含黄芪甲苷 7.5、25、37.5、50、100 μg，0.45 μm 微孔滤膜过滤，在 “2.2.3”项色谱条件下进样，以黄芪甲苷对照品溶液质量浓度的常数对数为横坐标（X），相应峰面积的常数对数值为纵坐标（Y）进行回归，得方程为 lgY=1.711 8lgX＋7.442 0（r=0.999 8），在 7.5～100 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 精密吸取供试品溶液，在 “2.2.3”项色谱条件下重复进样6 次。测得黄芪甲苷相对保留时间的RSD 为2.07%，峰面积RSD 为1.92%，表明该仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，在“2.2.3”项下色谱条件分别于 0、2、4、8、12、24 h 进样，测得黄芪甲苷峰面积RSD 为2.04%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 按 “2.2.1”项下方法平行制备供试品溶液6 份，在 “2.2.3”项色谱条件下进样，测得黄芪甲苷含有量RSD 为2.34%，表明该方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 分别精密吸取已测定的提取液共9 份，每 3 份为一组，按低、中、高 3 个水平精密加入黄芪甲苷对照品溶液适量，按 “2.2.1”项下方法制备供试品溶液，在 “2.2.3”项色谱条件下测定峰面积，测得黄芪甲苷的平均回收率为102.25%，RSD 2.84%。

2.2.9 样品含有量测定 按 “2.2.1”项下方法制备供试品溶液，在 “2.2.3”项色谱条件下测定峰面积，以外标法计算含有量，结果见表2。

2.3 干浸膏提取率测定 精密吸取提取液5 mL，置已干燥至恒定质量的蒸发皿中，水浴蒸干后，减压干燥至恒定质量，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量，计算干浸膏提取率，结果见表2。

2.4 多指标加权正交试验法优选提取工艺

2.4.1 水提工艺优选 在预试验基础上，选取药材加水量（A）、提取次数（B）、提取时间（C）等 3 个影响提取的主要因素，采用多指标加权正交试验法［8］，以 L9（34）正交表安排实验，以阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷得率以及干浸膏提取率的综合评分为指标，优选提取工艺。因素水平见表1。

表1 因素水平

2.4.2 正交试验设计 按处方比例称取黄芪、当归等14味药材，置5 000 mL 圆底烧瓶中，按照正交试验表安排试验进行提取，将提取液适当浓缩，以纯净水定容到250 mL量瓶中。将黄芪甲苷（X1）、阿魏酸（X2）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（X3）得率以及干浸膏提取率（X4）进行综合评分，评分时以各指标的最大值为参照，将数据进行归一化后设定不同权重，其中X1分值权重系数为0.25，X2分值权重系数为0.3，X3分值权重系数为0.25，X4分值权重系数为 0.2，得到综合指标。综合评分Y=X1／X1max×0.25＋X2／X2max×0.3＋X3／X3max×0.25＋X4／X4max×0.2。结果见表2，方差分析见表3。

表2 试验设计及结果

表3 方差分析

表2 可知，因素 A 中各水平影响大小顺序为 A3＞A2＞A1，因素 B 中各水平影响大小顺序为 B2＞B1＞B3，因素 C中各水平影响大小顺序为C3＞C2＞C1，各因素对提取工艺影响大小为 A＞B＞C，最佳提取条件为 A3B2C3；表3 表明，A、B、C 各因素对扶正救肺方提取工艺均有显著影响。综合考虑，最终提取工艺为加10 倍量的水提取3 次，每次1.5 h。

2.5 验证试验 以上述优化条件，平行3 次验证试验，见表4。黄芪甲苷得率、阿魏酸得率、毛蕊异黄酮得率、干浸膏提取率的平均值分别为 12.31 μg／g、99.51 μg／g、39.69 μg／g、55.43%，RSD 分 别 为 2.16%、0.79%、2.28%、1.38%，表明该工艺稳定可行，重复性良好，可用于提取。

表4 验证试验结果

3 讨论

本研究在不改变原处方传统提取方式（水煎）的基础上对其进行工艺筛选。在考察指标的选取方面，既选择作用明确、安全可靠的黄芪主要有效成分黄芪甲苷及主要药物川芎、当归共有的有效成分阿魏酸，又选取该方干浸膏提取率作为宏观、全面的考察指标，以体现中药复方多组分、多靶点的作用特点。

《香港中药材标准》 中对黄芪甲苷的测定方法，主要在于改进了2015年版 《中国药典》 中黄芪甲苷的提取方法及富集方法。以甲醇超声提取替代索氏提取；以氨试剂溶解提取物后再以水饱和正丁醇萃取来除去酚、酸性成分并富集皂苷类成分，代替了大孔吸附树脂富集纯化的过程。比较可知，该方法通过对样品处理进行2 方面的简化，有效缩短了测定时间，同时避免了索氏提取及柱色谱富集纯化给定量分析带来的操作误差。已有研究表明，2种方法测得的黄芪甲苷含有量结果没有显著性差异［7］。

查阅大量文献发现，以HPLC-ELSD 法测定黄芪甲苷含有量，线性关系考察中对回归方程的处理有并存的3种方法（直接以峰面积和进样量进行线性回归；以峰面积和进样量的自然对数进行线性回归；以峰面积和进样量的常数对数进行线性回归）。本研究对3种方法作了详细考察，直接以峰面积和进样量进行线性回归所得回归方程为Y=6×106X-91 671（r=0.981 1）；以峰面积和进样量的自然对数进行线性回归所得回归方程为lnY=1.711 8lnX＋17.135 7（r=0.999 8）；以峰面积和进样量的常数对数进行线性回归所得回归方程为 lgY=1.7118 lgX＋7.442 0（r=0.999 8）。结果表明，直接以峰面积和进样量进行线性回归所得的线性关系较差，而以自然对数和常数对数与进样量进行线性回归所得的回归系数相同，本研究最终以峰面积和进样量的常数对数进行线性回归。

本研究分别采用了2种检测器进行含有量测定。其中，二极管阵列检测器适用于有共轭结构、有紫外吸收物质的检测，具有灵敏度高、精密度好、线性范围广等优点，其缺点是不适用于无紫外吸收的组分。本实验中毛蕊异黄酮葡萄糖苷（260 nm）和阿魏酸（320 nm）均有紫外吸收，故选用二极管阵列检测器。蒸发光散射检测器灵敏度较低，适用于挥发性低于流动相的组分，特别适用于无紫外吸收或在紫外区有末端吸收的样品检测，黄芪甲苷在在紫外区只有末端吸收（200 nm），故选用蒸发光散射检测器。

扶正救肺颗粒是由14 味中药组成的复方，化学成分复杂，作用机制不明，为得到其稳定可控的提取工艺，本研究采用多指标加权评分法进行工艺优化，确定权重系数的方法一般分为2 类，即主观权重系数和客观权重系数，主观权重系数又叫经验权重系数，是主研者对分析对象的各个因素，按其重要程度，依据经验主观确定的系数，目前此类方法在中药提取工艺综合评价中多采用。通过查阅文献，根据各成分的药理作用与抗肺纤维化的相关性大小，以及在制剂中的含有量高低来确定各指标的权重比例。君药黄芪中的黄芪甲苷［9-11］及黄芪黄酮［12］是抑制肺纤维化的主要有效成分，而毛蕊异黄酮葡萄糖苷是黄芪中的代表性黄酮成分，其权重均取0.25；当归和川芎中都含有大量的阿魏酸，此成份在方中含有量相对较高，具有明确的抗肺纤维化作用［13-15］，故其权重取 0.3；干浸膏中含有多糖、黄酮、皂苷及其他水溶性成分，其抑制肺纤维化的程度相对较低且考虑成本问题，所以权重共取0.2。