不同配伍比例刺五加和树舌的镇静催眠作用

卢铭 王凤芝 李琪

摘要[目的]探究不同配伍比例刺五加-树舌灵芝醇提物对小鼠镇静催眠作用的影响。[方法]不同配伍比例的刺五加和树舌灵芝用75%乙醇作为溶剂，料液比为1∶20，利用冷凝回流提取1.5 h后得各配伍比例的乙醇提取物;利用差热分析仪对得到的不同配伍比例的乙醇提取物进行分析;应用苯巴比妥钠所致小鼠睡眠的方法，研究刺五加和树舌灵芝乙醇提取物改善睡眠的量效关系。[结果]差热分析结果显示，刺五加和树舌灵芝配比为1∶5和5∶1时，2种药物配伍后的相互作用明显。镇静催眠作用结果显示，配伍比例为1∶5、3∶1、4∶1、5∶1小鼠的体重依次显著增大（P<0.05）;配伍比例为1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、1∶4、1∶5、3∶1、4∶1、5∶1的给药组抑制小鼠的活动次数（P<0.05）依次增大;阈下剂量苯巴比妥钠对小鼠镇静催眠试验结果显示，所有给药组均有镇静催眠效果;阈上剂量苯巴比妥钠对小鼠镇静催眠试验结果显示，配伍比例为1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、1∶4、1∶5、3∶1、4∶1、5∶1的给药组镇静催眠作用（P<0.05）依次增大。[结论]刺五加-树舌灵芝配比为5∶1的醇提物对小鼠的镇静催眠作用效果最好，其作用优于单味药刺五加组和单味药树舌灵芝组。

关键词刺五加;树舌灵芝;翻正反射;醇提物;镇静催眠

中图分类号R285文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）03-0150-04

doi∶10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.048

刺五加是五加科（Araliaceae）五加属（Acanthopanax）刺五加[Acanthopanax senticosus（Rupr. Maxim.） Harms.]的干燥根及根茎或茎，又名坎拐棒子、一百针、老虎潦，在民间很早就供药用[1]，具有镇静催眠[2]、抗炎[3-4]、抗氧化[5-6]、抗辐射[7]、降糖[8]、抗疲劳[4]、抗缺氧[6]等作用。树舌为灵芝属（Ganoderma Karst.） 树舌灵芝（Ganoderma applanatumn）的子实体，别名树舌、平盖灵芝、扁目灵芝[9]，具有抗氧化[10]、免疫调节[11]、抗肿瘤[12-14]、保肝[15]、抗菌[16]等作用。

神经衰弱是由于长期处于紧张和压力下，出现精神易兴奋和脑力易疲乏等现象。现代医学尚无特效药治疗，西药一般治疗效果佳，但有一定副作用。中药中有许多具有安神功效的药物，毒副作用小，但需长期服用，疗效慢。

树舌灵芝性凉、刺五加性温，具有清肝热、补肝肾的作用。故笔者将二者联合使用对镇静催眠作用进行研究，为得到一种疗效好、见效快的镇静催眠复方中药提供依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1动物。实验动物为清洁级健康雄性昆明小鼠156只，体重18～22 g，由哈尔滨医科大学实验动物学部提供，合格证书SCXK（黑）-2013-001。分笼饲养小鼠，饲料供给充足、不限饮水，室温20～25 ℃，适应环境7 d后使用。

1.1.2试材。刺五加根及根茎，采自黑龙江省佳木斯市桦南县，树舌灵芝子实体采自佳木斯市汤原县大亮子河林场，二者经佳木斯大学王丽红教授认定为五加科五加属刺五加和灵芝属树舌灵芝。二者经粉碎机打磨成粗粉，供试验用。

1.1.3试剂。乙醇，分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司;地西泮注射液，批号1610212，天津金耀药业有限公司;苯巴比妥钠注射液，批号17121301，天津金耀药业有限公司。

1.1.4仪器与设备。RE-52A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂;FA2004分析天平仪，上海越平科学仪器（苏州）制造有限公司;YLS-1A多功能小鼠自主活动记录仪，济南益延科技发展有限公司;高温差热分析仪，上海精密仪器仪表有限公司。

1.2试验方法

1.2.1刺五加-树舌灵芝提取物的制备。

刺五加和树舌灵芝按配比1∶1（1号）、1∶2（2号）、1∶3（3號）、1∶4（4号）、1∶5（5号）、5∶1（6号）、4∶1（7号）、3∶1（8号）、2∶1（9号）、刺五加（10号）、树舌灵芝（11号），精确称取各配伍比例的刺五加和树舌灵芝共3.00 g，采用回流提取法，将原料放入500 mL圆底烧瓶中，使用75%乙醇溶液为提取溶剂，料液比1∶20，加入60 mL乙醇，提取时间1.5 h，抽滤，用旋转蒸发仪除去部分乙醇，再将所得滤液用电热套和坩埚蒸干溶液。

1.2.2差热分析测定方法。

此次试验研究不同配比刺五加-树舌灵芝复方制剂中活性成分，试验条件差热量程±5 μV;升温速率20 K/min;升温范围0～200 ℃;气氛为静态空气;参比物为空坩埚。

1.2.3刺五加-树舌灵芝对小鼠镇静催眠作用的研究。

1.2.3.1刺五加-树舌灵芝提取物的制备。

刺五加和树舌灵芝按配比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1精确称取刺五加-树舌灵芝共11.25 g，将原料放入500 mL锥形瓶中，使用75%乙醇溶液为提取溶剂，料液比1∶20，加入乙醇225 mL，浸泡24 h后，置于圆底烧瓶中，采用冷凝回流提取法，提取时间1.5 h，抽滤，将所得滤液用旋转蒸发器蒸干乙醇后，浓缩至浸膏，用所制备的羧甲基纤维素钠溶液定容至25 mL容量瓶中，制成浓度为0.45 g/mL的混悬液，以待使用。

1.2.3.2小鼠给药剂量的计算。

计算小鼠给药剂量，通过人所需给药剂量折算出小鼠给药剂量。小鼠的给药剂量（mg/kg）=W×人的临床用量（mg/kg）。人的临床用量为0.5 mg/kg，W=9.01，小鼠给药剂量4.505 mg/kg，含生药量为11.25 mg，小鼠体重20 g计算，给药剂量0.090 1 mg/只。

1.2.3.3动物分组及给药方法。

取体重18～22 g昆明小鼠156只，随机分为13组，每组12只，分别为空白（生理盐水）、对照组（羟甲基纤维素钠）、地西泮阳性对照组（0.15 mg/kg）、1∶1组、1∶2组、1∶3组、1∶4组、1∶5组、5∶1组、4∶1组、3∶1组、2∶1组、刺五加组、树舌灵芝组。灌胃给药，每日1次，灌胃剂量为每20 g灌胃0.2 mL。

（1）各给药组对小鼠体重的影响。按上述分组给药，连续给药7 d，分别记录每天小鼠体重的变化。

（2）各给药组对小鼠自主活动次数的影响。按上述分组给药，连续给药7 d，末次给药1 h 后，将各组小鼠分别放入自主活动仪暗箱中，适应环境2 min后，记录各组小鼠5 min 内自主活动次数，比较组间差异。

1.2.3.4不同给药组对阈上剂量苯巴比妥钠的小鼠催眠作用的影响。

将78只实验小鼠随机分为13组，每组6只，分别标号为刺五加∶树舌灵芝1∶1为1号、1∶2为2号、1∶3为3号、1∶4为4号、1∶5为5号、5∶1为6号、4∶1为7号、3∶1为8号、2∶1为9号、刺五加为10号、树舌灵芝为11号、空白、对照。空白组给予相同体积的羟甲基纤维素钠，对照组给予相同剂量的地西泮，连续灌胃7 d。第7天灌胃后，将13组实验小鼠皮下注射阈上剂量的苯巴比妥钠。以小鼠翻正反射消失时间记为睡眠潜伏期，以翻正反射消失的持续时间记为睡眠时间，分别记录各组入睡的睡眠潜伏期和睡眠时间。

1.2.3.5不同给药组对阈下剂量苯巴比妥钠的小鼠催眠作用的影响。

将78只实验小鼠随机分为13组，每组6只，分别标号为刺五加∶树舌灵芝1∶1为1号、1∶2为2号、1∶3为3号、1∶4为4号、1∶5为5号、5∶1为6号、4∶1为7号、3∶1为8号、2∶1为9号、刺五加为10号、树舌灵芝为11号、空白、对照。空白组给予相同体积的羟甲基纤维素钠，对照组给予相同剂量的地西泮，连续灌胃7 d。第7天灌胃后，将13组实验小鼠皮上注射阈下剂量的苯巴比妥钠，分别记录各组入睡的睡眠潜伏期和睡眠时间。

1.3统计学处理应用SPSS 20.0软件进行统计学分析，数据以±S表示，组间数据运用Duncans multiple range test方法进行单因素方差分析。根据P<0.05判断显著性。

2结果与分析

2.1差热分析法测定分析刺五加-树舌灵芝提取物

根据差热分析法（DTH）对不同比例刺五加和树舌灵芝醇提取物反应后的放热情况（图1）可知，配伍后的药物曲线和单独刺五加、单独树舌灵芝曲线明显不同，经分析后发现5号、6号曲线变化明显，混合后的产物在刺五加和樹舌单独提取物之间，且二者图形相近，所产生的物质相近，故将二者反应后的曲线和单独刺五加与树舌灵芝曲线作为对比。

2.2刺五加-树舌灵芝对小鼠镇静催眠作用研究

2.2.1各给药组对小鼠体重的影响。

根据小鼠昼伏夜出的习性，选择早上固定时间灌胃给药，连续灌胃7 d，并记录每天的小鼠体重，统计结果见表1。

2.2.2各给药组对小鼠自主活动次数的影响。从表2可看出，与给药前相比，给药后的1号、2号、3号、4号、5号、6号、7号、8号、9号、10号、11号，小鼠的自主活动次数均比给药前低。给药后各给药组与空白组相比，10号和11号无显著性差异（P>0.05），6号能显著减少小鼠的自主活动次数（P<0.05），其次为7号、8号、9号、3号、4号、5号、1号、2号。结果见表2。

2.2.3不同给药组对阈上剂量苯巴比妥钠镇静催眠作用的影响。

观察记录各给药组阈上剂量苯巴比妥钠对小鼠睡眠潜伏时间和睡眠时间（表3），与空白组比较，各给药组均缩短了小鼠入睡的潜伏时间。其中6号最显著（P<0.05），10号和11号对小鼠的潜伏期几乎没有影响（P>0.05），其余各组之间差异不大;与空白组比较，6号显著延长了小鼠睡眠时（P<0.05），10号和11号对小鼠的睡眠时间几乎没有影响（P>0.05）。

2.2.4不同给药组对阈下剂量苯巴比妥钠镇静催眠作用的影响。从表4可看出，与空白组相比，对照组及1号、2号、3号、4号、5号、6号、7号、8号、9号、10号、11号，对阈下剂量苯巴比妥钠诱导小鼠催眠均表现出协同作用，且6号小鼠睡眠潜伏期显著缩短（P<0.05），组间比较显示，3号、4号、5号、7号、8号之间无显著性差异（P>0.05），9号、10号、11号、1号、2号之间无显著性差异（P>0.05）;6号显著延长小鼠的睡眠时间（P<0.05），组间比较显示，7号和8号之间无显著性差异（P>0.05），3号、4号、5号、2号、9号之间无显著性差异（P>0.05），1号、2号、9号之间无显著性差（P>0.05），10号和11号之间无显著性差异（P>0.05）。

3结论

此次试验将刺五加和树舌灵芝按1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1不同比例配伍，用75%乙醇为溶剂，料液比为1∶20，采用冷凝回流提取法，旋蒸除去多余乙醇，浓缩，提取其有效成分，并与单独刺五加和树舌灵芝提取物进行对比，利用差热分析仪检测二者混合后是否有新物质产生，分析结果显示刺五加和树舌灵芝配比为5∶1和1∶5的效果最为明显，且两者所提取的化学物质基本相同，该方法操作简单、用药量少，能准确检测产物的吸放热情况，为接下来试验结果提供依据。

经对不同配伍比例刺五加和树舌灵芝醇提物对小鼠镇静催眠作用的研究，其中包括各给药组对小鼠行为学影响的试验、小鼠体重变化情况，苯巴比妥钠阈上及阈下镇静催眠试验，研究其提取物是否对小鼠具有镇静催眠效果，小鼠行为学试验结果显示，1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1对小鼠的活动均有抑制效果，组间比较刺五加-树舌灵芝配比为5∶1组效果最为明显（P<0.05）;直接睡眠试验结果显示，1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1组均有镇静作用，但不能致小鼠直接睡眠;苯巴比妥钠阈下镇静催眠试验结果显示，1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1能缩短小鼠睡眠潜伏期（P<0.05）及延长小鼠的睡眠时间，组间比较刺五加-树舌灵芝配比为5∶1组效果最为明显（P<0.05）;苯巴比妥钠阈上镇静催眠试验结果显示，1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1组可延长小鼠的睡眠时间（P<0.05），但是刺五加-树舌灵芝配比为5∶1组效果最为明显（P<0.05）。

试验证明刺五加和树舌灵芝配伍可显著提高镇静催眠效果，刺五加与树舌灵芝醇提物配比为5∶1时镇静催眠效果最为显著，疗效最好，具有开发新药的依据。

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