miR-34a通过SIRT1诱导高糖条件下骨髓间充质干细胞衰老*

刘晓虹， 张凤云， 王 坤， 王志荣， 张卓琦△

(1 徐州医科大学, 2徐州医科大学附属医院心内科， 江苏 徐州 221000)

缺血性心脏病(ischemic heart disease，IHD)是导致全世界人类死亡的主要原因之一，而心肌梗死后的心力衰竭更加重了健康负担[1]。临床心肌梗死患者往往同时患有糖尿病[2]，合并高糖血症增加了心肌梗死患者死亡率和住院期间的并发症[3]。目前治疗IHD的方法仅能延缓，而不能阻止或者逆转其所带来的心力衰竭的发生[4]。近年来干细胞疗法作为心肌梗死新兴的治疗方法备受关注，其中，骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)以其易于获取和增殖等特点成为首选种子细胞。BMSCs移植可以通过促进多种细胞因子分泌，包括血管内皮生长因子、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子等，促进心肌梗死患者心功能的恢复[5]，但糖尿病患者自体干细胞却无法完成这一修复作用[6]，提示长期高糖暴露严重损害了BMSCs的功能。深入研究表明高糖条件下的BMSCs表现为早衰、基因组不稳定和端粒改变[7-9]，但是高糖条件下BMSCs衰老的发生和调控机制尚不明确。此外，异体移植干细胞的免疫原性和伦理问题是目前干细胞移植领域尚未攻克的难题，糖尿病患者限于以上种种原因往往需要移植自身的干细胞。因此，如何有效提高这类患者干细胞的功能及移植效率，这是近年来心肌梗死合并糖尿病患者干细胞疗法的研究重点。

作为靶向P53的微小RNA(microRNA，miRNA，miR)，miR-34a可通过多种信号途径调节细胞的增殖、衰老等[10]。既往研究发现，miR-34a在心肌梗死[11]和糖尿病[12]患者血清中均显著升高，因此可能参与心肌梗死合并糖尿病的发生及发展。本课题探究外源性miR-34a是否可加重高糖条件下BMSCs衰老的发生，并探究miR-34a促衰老的机制及其相关信号通路，为进一步临床应用糖尿病患者自体BMSCs治疗糖尿病心肌梗死提供理论依据。

材 料 和 方 法

1 实验动物

雄性SD大鼠(3周龄)，60～80 g，购于徐州医科大学实验动物中心，合格证编号为2201172797。

2 主要试剂

胎牛血清购自依科赛生物科技有限公司；DMEM/高糖(high glucose,HG)和DMEM/正常浓度糖(normal glucose,NG)培养基均购自HyClone；胰酶细胞消化液和细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒均购于碧云天生物有限公司；rno-miR-34a-5p 和沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)引物均由北京天根生化科技有限公司设计及合成；rno-miR-34a-5p 过表达/沉默序列和siRNA-SIRT1序列(表 1)均由苏州吉玛基因股份有限公司合成；X-treme siRNA Transfection Reagent购自Roche；抗SIRT1和叉头框蛋白O3a(forkhead box O3a，FOXO3a)抗体均购自Cell signaling；抗P21抗体购自Abcam；抗GAPDH兔多克隆抗体购于武汉三鹰生物技术有限公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；CCK-8试剂盒购自Dojindo。

3 主要方法

3.1 大鼠BMSCs的分离及培养 提取健康雄性SD大鼠(60～80 g) 股骨及胫骨骨髓，参考文献方法[13]采用全骨髓培养法获得BMSCs，该实验所用细胞均为3～5代培养于DMEM/NG培养基中的细胞，生长状态良好。应用流式细胞术方法对其表面特殊标记抗体进行鉴定，BMSCs高表达CD90，CD29和CD44，几乎不表达CD34和CD45。

3.2 高糖培养细胞模型的建立 取3～5代培养的BMSCs，参考文献[14]方法将细胞分为2组：一组细胞继续培养于DMEM/NG(含糖5.5 mmol/L)培养基中作为正常糖对照组(NG组)，另一组细胞培养于DMEM/HG (含糖25 mmol/L)培养基中作为HG组(用于模拟糖尿病患者体内高糖微环境)，当BMSCs生长达70%～80%融合时及时传代，连续培养4 周进行后续实验。

3.3 CCK-8法检测BMSCs的活力 将NG组与HG组的BMSCs按每孔3 000个细胞接种于96孔板，CCK-8法检测不同浓度葡萄糖对细胞活力的影响。为进一步探索miR-34a在高糖条件下对BMSCs活力的影响，取HG组BMSCs分别转染miR-34a mimic、miR-34a inhibitor和miR-34a NC，48 h后用CCK-8法检测细胞活力的变化。具体操作参照CCK-8试剂盒说明书，用酶标仪测定样本450 nm波长处吸光度(A)值。

3.4 过表达或沉默miR-34a或SIRT1基因的表达 将BMSCs按每孔2×105个细胞接种于6孔板，过夜培养。转染操作按X-treme siRNA Transfection Reagent说明书，参考文献[13]方法将20 nmol/L miR-34a mimic/inhibitor转染至BMSCs中过表达或沉默miR-34a，将100 nmol/L siRNA-SIRT1转染至BMSCs中敲减SIRT1的表达，各因子转染时间均为48 h。

3.5 RT-qPCR法检测BMSCs的miR-34a及SIRT1 mRNA的表达水平 各组细胞处理结束后，TRIzol试剂一步从BMSCs中提取总RNA，采用两步法进行RT-qPCR反应。miR-34a、SIRT1、U6和β-actin上下游引物均由北京天根生化科技有限公司设计及合成，具体序列见表1(其中rno-miR-34a-5P反向引物由天根试剂盒内自带)。结果采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。

表1 RT-qPCR的引物序列和miR-34a mimic/inhibitor的寡核苷酸序列

3.6 Western blot分析 各组细胞处理结束后，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取总蛋白；经BCA法测定浓度后行聚丙烯酰胺凝胶电泳；按照湿转方法将蛋白转印到PVDF膜上；5%脱脂奶粉溶液37 ℃ 孵育2 h；I 抗4 ℃孵育过夜；TBST洗膜后 II 抗37 ℃孵育1 h；再次洗膜，增强化学发光法显色。用Image J图像分析软件进行半定量分析，GAPDH作为内参照。

3.7 衰老相关β-半乳糖苷酶染色法检测衰老细胞 各组细胞处理结束后，经PBS 冲洗，加入β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min，PBS再次冲洗后，加入染色工作液，37 ℃无CO2条件下孵育过夜；普通光学显微镜下观察，每个样本计数600个细胞，胞浆蓝染者为衰老细胞，计数阳性细胞占观察细胞总数的百分比。

4 统计学处理

用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析。数据均以均数±标准差(mean±SD)表示，两组比较采用Student-t检验方法，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 在高糖条件下BMSCs中miR-34a生成增加

将BMSCs置于NG或HG培养基中连续培养4周，RT-qPCR检测miR-34a的表达情况。结果显示与NG组相比，HG组的miR-34a表达明显上调(P<0.01)，见图1A。为了进一步研究miR-34a对BMSCs功能的影响，我们应用转染的方式增加miR-34a或抑制miR-34a的表达，RT-qPCR技术验证转染效率，结果表明与HG组相比，HG+miR-34a mimic组的miR-34a表达明显上调(P<0.01)，HG+miR-34a inhibitor组的miR-34a表达明显下调(P<0.01)，且HG组与HG+miR-34a NC组间的差异无统计学显著性，见图1B。

Figure 1. The relative expression of miR-34a in each group of the BMSCs was detected by RT-qPCR. U6 was used as an internal control. A: the effect of high glucose on the expression of miR-34a in the BMSCs; B: detection of transfection efficiency. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNG group;##P<0.01vsHG group.

图1 RT-qPCR法检测各组细胞中miR-34a的相对表达量

2 miR-34a与高糖条件下BMSCs的活力有关

本实验用CCK-8法检测高糖对BMSCs活力的影响，结果显示第3 天开始，HG组较NG组的细胞活力减弱(P<0.05)，见图2A；为进一步探索miR-34a与高糖条件下BMSCs活力的关系，用CCK-8法检测转染了miR-34a mimic和miR-34a inhibitor 48 h之后的BMSCs的活力，结果显示第3天开始，HG+miR-34a mimic组较HG+miR-34a NC组细胞活力明显减弱(P<0.01)，见图2B；而HG+miR-34a inhibitor组较HG+miR-34a NC组表现出较好的细胞活力(P<0.01)，见图2C。

Figure 2. The effect of miR-34a on the viability of BMSCs under high glucose condition was detected by CCK-8 assay. A: the effect of high glucose on the viability of BMSCs; B: the effect of miR-34a mimic on the viability of BMSCs under high glucose condition; C: the effect of miR-34a inhibitor on the viability of BMSCs under high glucose condition. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNG group;##P<0.01vsHG+miR-34a NC group.

图2 CCK-8法检测miR-34a对高糖条件下BMSCs活力的影响

3 miR-34a与高糖条件下BMSCs衰老有关

与NG组相比，HG组β-半乳糖苷酶阳性染色细胞数明显增加(P<0.01)；为进一步探索miR-34a与高糖条件下BMSCs衰老的关系，我们检测转染了miR-34a mimic和miR-34a inhibitor 之后的BMSCs的衰老水平，结果表明与HG组相比，HG+miR-34a mimic组的β-半乳糖苷酶阳性染色细胞数明显增加(P<0.01)，HG+miR-34a inhibitor组的β-半乳糖苷酶阳性染色细胞数明显减少(P<0.01)，且HG组与HG+miR-34a NC组间的差异无统计学显著性，见图3。与上述染色结果一致，Western blot结果显示，与NG组相比，HG组的P21表达水平明显升高(P<0.01)；与HG组相比，HG+miR-34a mimic组的P21表达水平明显升高(P<0.01)，HG+miR-34a inhibitor组的P21表达水平明显降低(P<0.01)，见图4。

Figure 3. The effect of miR-34a on the senescence of BMSCs under high glucose condition was detected by senescence-associated β-galactosidase assay (×100). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNG group;##P<0.01vsHG group.

图3 衰老相关β-半乳糖苷酶染色法检测miR-34a对高糖条件下BMSCs衰老水平的影响

4 miR-34a可调控高糖条件下BMSCs中SIRT1和FOXO3a的表达

综合了miRBase、 TargetScan、 PicTar和miRanda四大软件库，采用生物信息学方法分析，结果表明SIRT1是miR-34a的潜在靶点。为了验证miR-34a是否影响高糖条件下BMSCs中SIRT1的表达，分别用RT-qPCR和Western blot法从mRNA和蛋白水平进行验证。结果显示在mRNA水平，各组细胞中SIRT1的mRNA表达水平的差异无统计学显著性，SIRT1不受miR-34a表达情况的影响，见图5；但在蛋白水平，与NG组相比，HG组的SIRT1表达水平明显降低(P<0.01)；与HG组相比，HG+miR-34a mimic组的SIRT1表达水平明显降低(P<0.01)， HG+miR-34a inhibitor组的SIRT1表达水平明显升高(P<0.01)，见图6。上述结果表明，SIRT1受miR-34a转录后负向调节。此外，我们进一步用Western blot技术检测了FOXO3a蛋白的表达情况，结果显示与NG组相比，HG组的FOXO3a蛋白表达水平明显升高(P<0.01)；与HG组相比，HG+miR-34a mimic组的FOXO3a蛋白表达水平明显升高(P<0.01)，HG+miR-34a inhibitor组的FOXO3a蛋白表达水平明显降低(P<0.01)，见图7。

Figure 4. The effect of miR-34a on the protein expression of P21 in the BMSCs under high glucose condition was determined by Western blot. GAPDH was used as an internal control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNG group;##P<0.01vsHG group.

图4 Western blot检测miR-34a对高糖条件下BMSCs中P21蛋白表达水平的影响

Figure 5. The effect of miR-34a on the mRNA expression of SIRT1 in the BMSCs under high glucose condition was detected by RT-qPCR. β-actin was used as an internal control. Mean±SD.n=3.

图5 RT-qPCR法检测miR-34a对高糖条件下BMSCs中SIRT1 mRNA表达水平的影响

5 高糖条件下BMSCs中miR-34a 诱导细胞衰老与SIRT1紧密相关

确定SIRT1为miR-34a靶蛋白之后，为了证实miR-34a是否通过调节SIRT1的表达来调控高糖条件下BMSCs衰老的发生，我们向HG组BMSCs中转染miR-34a inhibitor或siRNA-SIRT1或者两者共同转染，Western blot法验证siRNA-SIRT1转染效率。结果显示与HG组相比，HG+siRNA-SIRT1组的SIRT1表达水平明显降低(P<0.01)；与HG+miR-34a inhibitor组相比，HG+miR-34a inhibitor+siRNA-SIRT1组SIRT1表达降低(P<0.01)，见图8。进一步研究发现，类似于miR-34a mimic转染组，与HG组相比，HG+siRNA-SIRT1组的P21表达水平明显升高(P<0.01)，即在高糖条件下BMSCs衰老的调节过程中，敲减SIRT1表达与过表达miR-34a发挥着相似的作用，并且当向HG+miR-34a inhibitor组加入siRNA-SIRT1后，miR-34a inhibitor对BMSCs中P21表达的抑制作用被部分减弱(P<0.05)，见图9。

6 miR-34a通过SIRT1/FOXO3a信号通路诱导高糖条件下BMSCs衰老的发生

与HG组相比，HG+siRNA-SIRT1组的FOXO3a表达水平明显升高(P<0.01)，HG+miR-34a inhibitor组的FOXO3a表达水平明显降低(P<0.01)，而当向HG+miR-34a inhibitor组加入siRNA-SIRT1后，miR-34a inhibitor对FOXO3a的抑制作用被部分减弱(P<0.05)，见图10。

Figure 6. The effect of miR-34a on the protein expression of SIRT1 in the BMSCs under high glucose condition was determined by Western blot. GAPDH was used as an internal control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNG group;##P<0.01vsHG group.

图6 Western blot检测miR-34a对高糖条件下BMSCs中SIRT1蛋白表达水平的影响

Figure 7. The effect of miR-34a on the protein expression of FOXO3a in the BMSCs under high glucose condition was determined by Western blot. GAPDH was used as an internal control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNG group;##P<0.01vsHG group.

图7 Western blot检测miR-34a对高糖条件下BMSCs中FOXO3a蛋白表达水平的影响

Figure 8. The protein expression of SIRT1 in each group of the BMSCs was determined by Western blot. GAPDH was used as an internal control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNG group;##P<0.01vsHG group;△△P<0.01vsHG+siRNA-SIRT1 group;▲▲P<0.01vsHG+miR-34a inhibitor group.

图8 Western blot检测各组细胞中SIRT1蛋白的表达水平

Figure 9. miR-34a increased the expression of P21 protein in the BMSCs under high glucose condition by decreasing SIRT1 expression. GAPDH was used as an internal control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNG group;##P<0.01vsHG group;△△P<0.01vsHG+siRNA-SIRT1 group;▲P<0.05vsHG+miR-34a inhibitor group.

图9 miR-34a通过SIRT1调控高糖条件下BMSCs中P21蛋白的表达

Figure 10. miR-34a increased the protein expression of FOXO3a in the BMSCs under high glucose condition by decreasing SIRT1 expression. GAPDH was used as an internal control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNG group;##P<0.01vsHG group;△△P<0.01vsHG+siRNA-SIRT1 group;▲P<0.05vsHG+miR-34a inhibitor group.

图10 miR-34a通过SIRT1调控高糖条件下BMSCs中FOXO3a蛋白的表达

讨 论

随着细胞治疗研究的深入，以干细胞为基础的细胞疗法是目前干预心肌梗死的有效手段，但长期高糖暴露严重损害了BMSCs的功能。深入研究表明高糖条件下的BMSCs表现为衰老增加和增殖能力下降[14]。显然，衰老的BMSCs是不适合作为种子细胞来进行移植的。那么如何降低高糖条件下BMSCs衰老的发生，进而提高其功能和移植效率是我们目前急需解决的问题。

miRNAs是一类高度保守的非编码单链小分子RNA，长约21～25 nt，广泛存在于真核生物中，并在基因转录后水平发挥重要的调控功能[15]。随着人们对糖尿病和心血管病发生机制研究的深入，近年来研究表明多种miRNAs参与糖尿病和心血管病发生发展的调控[16]。在已知的miRNAs中，miR-34a作为P53的靶向小分子RNA，其与衰老的关系在众多研究中到得一定阐释[10]。miR-34a隶属于miR-34家族，普遍存在于肺组织之外的各种组织中[17]。此外，研究发现miR-34a在心肌梗死[11]和糖尿病[12]患者血清中均显著升高。

本实验中我们首先证实了miR-34a确实表达于BMSCs中，其次我们发现在高糖条件下BMSCs中miR-34a的表达明显上调，过表达miR-34a可以加重高糖条件下BMSCs的衰老水平，同时降低BMSCs的活力，而抑制miR-34a的表达则表现出相反的效应。

SIRT1是miR-34a的潜在靶点之一，在以往多项研究中被认为是一种长寿基因[18]，它是一种依赖烟碱胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的去乙酰化酶[19]，主要通过使下游靶蛋白去乙酰化而在细胞周期[20]和衰老[21]等的调节中发挥关键作用。既往研究表明在氧化应激条件下，SIRT1可以通过促进FOXO3a去乙酰化，进而抑制其转录活性[22]。FOXO3a是叉头基因转录因子家族的一员，与多种细胞功能有明显联系，包括氧化应激[22]和衰老等[23]。此外，研究表明FOXO3a与糖尿病等代谢性疾病密切相关[24]。

本实验中，我们发现在高糖条件下BMSCs中SIRT1蛋白表达明显降低，FOXO3a蛋白表达明显升高，过表达miR-34a进一步加重SIRT1表达的降低和FOXO3a表达的升高，而抑制miR-34a的表达则表现恰恰相反。但在mRNA水平，SIRT1不受miR-34a表达情况的影响。以上研究表明SIRT1受miR-34a转录后负向调节。进一步研究发现在高糖条件下，敲减BMSCs中SIRT1表达与过表达miR-34a对P21及FOXO3a蛋白的调节发挥着相似的作用，并且当向HG+miR-34a inhibitor组加入siRNA-SIRT1后，miR-34a inhibitor对高糖条件下BMSCs中的P21及FOXO3a表达的抑制作用被部分减弱。综上所述，我们的研究结果表明miR-34a通过SIRT1/FOXO3a信号通路诱导高糖条件下BMSCs衰老。因此，抑制miR-34a的表达为临床优化糖尿病患者自体干细胞治疗糖尿病心肌梗死提供了实验依据和新的理论支持。