糖尿病患者低密度脂蛋白通过激活caspase-12途径诱导小鼠巨噬细胞凋亡*

王志超， 张 弛， 张 燕， 岳 峰， 田 华， 焦 鹏， 秦树存， 薛雅卓， 姚树桐, 3△

(泰山医学院 1护理学院， 2动脉粥样硬化研究所， 山东省高校动脉粥样硬化重点实验室， 3基础医学院， 山东 泰安 271000； 4解放军总医院， 北京 100853； 5泰安市中心医院， 山东 泰安 271000)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)作为心脑血管疾病的主要病理基础，是一个复杂的多细胞参与的慢性炎症性病理过程，其中修饰后脂蛋白所诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞形成和凋亡是AS发展的核心环节和造成斑块不稳定的决定性因素，进而导致急性心脑血管病事件的发生[1]。近年来大量研究表明由caspase-12和C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)等介导的内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡途径的活化参与了巨噬源性泡沫细胞凋亡过程，并在AS易损斑块的形成中起着关键作用[2-4]。血脂异常是导致AS的主要危险因素之一，其中氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)可引起内皮细胞损伤及泡沫细胞形成、凋亡和坏死，进而导致粥样斑块破裂，是公认的AS独立危险因子。低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)除被氧化修饰外，也可在糖尿病环境中被糖基化修饰，形成糖基化脂蛋白，触发氧化应激，诱导CD36介导的血管平滑肌源性泡沫细胞形成[5]，并导致血管内皮细胞功能障碍和损伤[6]。既往研究中所采用的糖基化脂蛋白主要是在体外与糖共孵育经非酶促反应制备而成[7-8]，其生物特性与糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者体内的糖基化修饰脂蛋白可能还有一定的差异，因此为了进一步证明糖基化脂蛋白致AS的临床意义，本研究提取了糖尿病患者血浆低密度脂蛋白(LDL from DM patients，DM-LDL)，探讨其对小鼠巨噬细胞凋亡的诱导作用及机制。

材 料 和 方 法

1 主要试剂

抗β-actin抗体、衣霉素(tunicamycin，TM)和4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid，PBA)(Sigma)；羧甲基赖氨酸(Nε-carboxy methyl lysine，CML)酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(上海蓝基生物技术有限公司)；DMEM高糖培养基(HyClone)；胎牛血清(Gibco)；4×蛋白上样缓冲液、二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)、 RIPA裂解液和BCA蛋白定量试剂盒(北京索莱宝公司)；四甲基偶氮唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-y-l)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT](Genview)；Annexin V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI)细胞凋亡检测试剂盒(凯基生物技术股份有限公司)；兔抗小鼠caspase-12多克隆抗体(Abcam)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(北京中杉金桥公司)；增强型化学发光试剂盒(Pierce)；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(Millipore);乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

2 方法

2.1 DM-LDL的提取 选取2017年1月～2017年12月接诊的52例2型糖尿病患者，均符合2型糖尿病的诊断标准[9]，排除急性心肌梗死、半年内发生过不稳定性心绞痛或脑卒中、合并急慢性感染疾病、甲状腺疾病、血液系统疾病、自身免疫系统疾病以及严重心肺、肝肾功能不全等患者。以血糖正常的健康志愿者为正常对照。收集空腹血浆，按照既往报道的方法[10]提取LDL，并采用ELISA法检测其中的CML含量以评价其糖基化程度。实验方案经泰山医学院伦理委员会审议并通过，所有患者均签署知情同意书。

2.2 细胞培养与实验分组 小鼠源RAW264.7巨噬细胞(中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库)用含10%胎牛血清、100 mg/L链霉素和1×105U/L青霉素的DMEM高糖培养基，于5% CO2、37 ℃培养箱内培养。细胞处理前用无血清培养基处理12 h，随机分为：(1)正常对照 (control) 组：培养液中常规培养；(2)正常人来源低密度脂蛋白(normal LDL,n-LDL)处理组：培养液中加入50 mg/L n-LDL；(3) DM-LDL处理组：培养液中加入不同浓度 (25、50和100 mg/L) 的DM-LDL；(4) ERS诱导剂TM处理组：培养液中加入4 mg/L TM；(5) ERS抑制剂PBA预处理组：培养液中预先加入5 mmol/L PBA作用1 h，再加入100 mg/L DM-LDL。处理24 h后收集细胞。

2.3 MTT法检测细胞活力 接种于96孔板的细胞经处理后，按既往报道的MTT分析方法[11]，检测各孔吸光度(A)值。以正常对照组细胞A值为100%，其余各实验组A值以其各自占正常对照组A值的百分比表示。

2.4 LDH活性测定 接种于6孔板的细胞经处理后，收集上清培养液，2 500 r/min离心10 min，按照LDH试剂盒说明书检测上清液中LDH活性，以U/L表示。

2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 细胞经过处理后，用不含EDTA的胰酶消化收集，冷PBS洗涤细胞2次，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞；加入5 μL Annexin V-FITC混匀，再加入5 μL PI混匀；室温、避光反应15 min，流式细胞术检测细胞凋亡情况。

2.6 Western blot分析 按本课题组以前报道的方法[11]，即采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法蛋白定量，并加入4×上样缓冲液，95 ℃中变性5 min。等量的各组总蛋白行SDS-PAGE分离并电转移至PVDF膜上，根据Marker条带裁剪所需目的蛋白和内参照蛋白所对应的膜，经5%脱脂奶粉封闭4 h后，分别用兔多克隆抗体caspase-12(1 600)和鼠单克隆抗体β-actin(1 1 500)4 ℃孵育过夜(或室温4～6 h孵育)，1×TBS-T洗膜3次,每次10 min，再与相应辣根过氧化物酶标记的 II 抗室温孵育2 h。以β-actin作为内参照。增强型化学发光法显色，应用化学发光成像仪(上海欧翔科学仪器有限公司)进行图像采集。各蛋白条带积分吸光度(integral absorbance，IA)值采用Image-Pro Plus软件分析，并以靶蛋白IA值/β-actinIA值的比值反映靶蛋白的相对水平。

3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示。采用Student’st检验分析两组间差异，单因素方差分析(one-way ANOVA)检验多组间差异，组间两两比较应用SNK法。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 糖尿病患者和健康对照者的血糖、血脂及LDL中CML水平的比较

糖尿病患者符合2型糖尿病的诊断标准，其空腹血糖、甘油三酯和LDL均高于健康对照组(P<0.05)，且与健康对照组比较，糖尿病患者血浆LDL中的CML水平明显增高(P<0.01)，见表1。

2 DM-LDL诱导RAW264.7细胞损伤

分别采用MTT法和LDH试剂盒测定RAW264.7细胞的活力和LDH漏出情况，结果显示与正常对照组相比，n-LDL处理组细胞活力和培养基中LDH活性的差异无统计学显著性(P>0.05)；而DM-LDL可明显导致细胞损伤，表现为细胞活力降低，LDH漏出增加，尤其以50和100 mg/L浓度时更为显著(P<0.01)，其对细胞的损伤作用与ERS诱导剂TM相似，见图1。

表1 糖尿病患者和健康对照者空腹血糖、血脂和LDL中CML水平

Table 1. Fasting glucose and lipids in plasma and CML level in LDL of DM patients and healthy controls (Mean±SD)

*P<0.05,**P<0.01vshealthy controls.

Figure 1. DM-LDL induced RAW264.7 cell injury. The cell viability (A) and LDH activity (B) in media were determined. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图1 DM-LDL诱导RAW264.7细胞损伤

3 DM-LDL诱导RAW264.7细胞凋亡

与正常对照组比较，n-LDL处理组的细胞凋亡率无明显增加(P>0.05)；而50和100 mg/L的DM-LDL分别使凋亡率增加2.68和4.91倍(P<0.01)；TM作为阳性对照组，其细胞凋亡率为正常对照组的4.14倍(P<0.01)，见图2。

Figure 2. DM-LDL induced apoptosis of RAW264.7 cells.The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry with Annexin V-FITC staining and expressed as the percentage of the number of Annexin V-FITC-positive cells to total cells. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group.

图2 DM-LDL诱导RAW264.7细胞凋亡

4 DM-LDL诱导caspase-12活化

Western blot检测结果显示，n-LDL处理组的cleaved caspase-12水平与正常对照组比较差异无统计学显著性(P>0.05)。50和100 mg/L DM-LDL处理组的cleaved caspase-12水平较正常对照组显著增加(P<0.01)，TM组cleaved caspase-12水平亦较正常对照组显著增加(P<0.05),见图3。

5 PBA抑制DM-LDL诱导的RAW264.7细胞损伤

与DM-LDL组比较，ERS抑制剂PBA预处理可明显减轻DM-LDL所致的RAW264.7细胞损伤，表现为细胞活力增加，LDH漏出减少(P<0.05)，见图4。

6 PBA抑制DM-LDL诱导的RAW264.7细胞凋亡

与DM-LDL组比较，PBA预处理组的细胞凋亡率明显降低(P<0.05)，提示PBA可减少DM-LDL所致的RAW264.7细胞凋亡，见图5。

Figure 3. DM-LDL induced activation of caspase-12. The protein levels of caspase-12 were examined by Western blot analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图3 DM-LDL诱导caspase-12活化

Figure 4. PBA inhibited DM-LDL-induced RAW264.7 cell injury. The cells were pretreated with PBA (5 mmol/L) for 1 h and then incubated with DM-LDL at 100 mg/L for 24 h. The cell viability (A) and LDH activity (B) in the media were measured, respectively. Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsDM-LDL group.

图4 PBA抑制DM-LDL诱导RAW264.7细胞损伤

7 PBA抑制DM-LDL诱导的caspase-12活化

PBA明显抑制DM-LDL所诱导的caspase-12活化，与DM-LDL组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，见图6。

讨 论

AS 作为心脑血管疾病的主要病因，对人类的健康产生严重危害，而巨噬细胞作为粥样斑块中的主要炎性细胞，与AS进展尤其晚期粥样斑块的破裂紧密相关。在AS晚期病变中，巨噬细胞过度凋亡通过分泌细胞炎性因子和蛋白水解酶促进脂质核心的增大，加剧炎症反应和坏死，导致粥样斑块稳定性下降、破裂以及继发血栓的形成，最终引起急性缺血性事件如心肌梗死、中风的发生[12]。DM是AS的主要独立危险因素，研究表明AS在DM患者中的发生率是非DM患者的4～8倍[13]，其机制与晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)关系密切。DM患者血浆蛋白长期处于高血糖环境中，通过非酶促糖基化反应形成AGEs，从而通过损伤内皮屏障、促进泡沫细胞形成和凋亡以及钙的沉积而破坏血管壁的完整性，同时还能通过受体依赖和非受体依赖途径启动氧化应激和炎症级联反应，促进斑块从稳态发展到易损状态并最终趋于破裂和血栓形成[14]。研究表明晚期糖基化白蛋白(advanced glycated albumin，AGE-alb)通过诱导炎症反应和氧化应激等途径促进冠状动脉粥样硬化，加速血管病变的进展[15-16]，本课题组既往研究也证实，AGE-alb可诱导巨噬细胞凋亡[17]。 LDL作为血浆中主要的脂蛋白，除被氧化修饰外，也可在糖尿病环境中被糖基化修饰。文献报道在体外与糖共孵育制备的糖基化LDL可诱导氧化应激、血管平滑肌源性泡沫细胞形成，促进炎症因子表达和巨噬细胞黏附并导致血管内皮细胞损伤[5-8]。本研究结果显示，提取的DM-LDL中CML水平明显增高，表明其已被糖基化修饰，并能够导致小鼠巨噬细胞损伤，表现为细胞活力降低，LDH漏出和细胞凋亡增加，且其作用与ERS诱导剂衣霉素相似，提示DM-LDL可能通过激活ERS凋亡途径诱导巨噬细胞凋亡。

Figure 5. PBA inhibited DM-LDL-induced apoptosis of RAW264.7 cells. The cell apoptosis was analyzed by Annexin V-FITC/PI staining and expressed as the percentage of the number of Annexin V-FITC-positive cells to the total cells. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsDM-LDL group.

图5 PBA抑制DM-LDL所致的RAW264.7细胞凋亡

Figure 6. PBA inhibited DM-LDL-induced activation of caspase-12. The protein levels of caspase-12 were examined by Western blot analysis. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsDM-LDL group.

图6 PBA抑制DM-LDL所诱导的caspase-12活化

内质网是真核细胞内蛋白、脂质合成的重要细胞器，同时也是Ca2+储存的重要场所，其对环境变化十分敏感。氧化应激、脂质过度聚集和高血糖等多种因素均可导致内质网功能失衡，从而出现以未折叠/错误折叠蛋白聚集和钙稳态失衡为主要特征的ERS反应。一定程度的ERS通过暂时性抑制蛋白合成、激活内质网相关蛋白降解途径和上调分子伴侣调控内质网功能，达到维持细胞生存的目的[18-19]。但是过强或长时间ERS则通过激活ERS凋亡途径诱导细胞凋亡，导致不可逆损伤，已有研究表明该过程可介导糖尿病患者内皮细胞功能失调和AS的进展[20]。Caspase-12是介导ERS凋亡机制的关键分子之一，位于内质网膜以酶原形式存在，在ERS过程中被特异性剪切激活，进而通过激活 caspase-3和caspase-9诱导细胞凋亡[21]。文献报道[21]和我们既往研究[17]表明，ox-LDL和AGE-alb通过激活caspase-12途径诱导人脐静脉内皮细胞和巨噬细胞凋亡，而成纤维细胞生长因子21[22]和大蒜素[23]可通过抑制caspase-12介导的ERS凋亡途径减轻ApoE-/-小鼠AS斑块细胞凋亡和巨噬源性泡沫细胞凋亡。本实验结果显示，与ERS诱导剂TM相似，给予RAW264.7巨噬细胞DM-LDL处理24 h，caspase-12活化水平明显上调，而给予ERS 抑制剂 PBA预处理则显著抑制DM-LDL所致的caspase-12活化，并可减轻小鼠巨噬细胞损伤和凋亡，表明caspase-12途径可能是介导DM-LDL所诱导小鼠巨噬细胞凋亡的重要机制。PBA预处理虽然可减轻DM-LDL所诱导的细胞凋亡，但其凋亡率仍显著高于正常对照组，表明可能还有其它机制参与该凋亡过程。CHOP是介导ERS凋亡途径的另一关键分子，并在AS易损斑块形成中具有重要作用[3, 10, 19]，其是否介导DM-LDL所诱导的巨噬细胞凋亡，还有待进一步阐明。

综上所述，本实验结果表明DM-LDL可诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡，其机制可能与激活caspase-12介导的ERS 凋亡途径有关。