过表达PGC-1α抑制高糖条件下小鼠视网膜感光细胞凋亡*

李朝辉， 张 睿， 何俊文， 李祥芸， 吴建华

(武汉爱尔眼科医院眼底病科， 湖北 武汉 430063)

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)特有和常见的微血管并发症之一，可使患者出现严重的视力损伤[1]。目前认为DR患者在出现微血管系统病变前会出现神经组织损伤，其病理特征主要表现为神经元凋亡、内层视网膜变薄及神经胶质细胞异常活跃等[2]。DR的发生发展是一个错综复杂的过程，目前认为DR的发病机制与高血糖、细胞凋亡、多元醇代谢异常、氧化应激、线粒体损伤、细胞因子及自由基作用等多种因素相关，且细胞凋亡是糖尿病大鼠视网膜神经元损害的主要形式[3-4]。由于神经组织损伤后的再生能力较差，因此，研究神经保护在DR治疗中的作用具有重要意义。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)是一种强有力的线粒体和氧化代谢调节酶，已有研究证明它和视网膜血管的发生以及缺血状态时新生血管的形成密切相关[5]。基于PGC-1α在新陈代谢和线粒体氧化作用中的关键作用，我们猜想PGC-1α在糖尿病视网膜病变早期视网膜感光细胞的凋亡中也扮演着重要的角色。本研究在视网膜感光细胞中过表达PGC-1α，探讨其对视网膜感光细胞凋亡的影响，为DR中神经元的保护提供一种新的思路。

材 料 和 方 法

1 实验材料

小鼠视网膜感光细胞株RGC-5购自武汉华联科生物技术有限公司。高糖DMEM培养基、普通DMEM培养基和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)均购自Gibco；Annexin V-FITC/PI试剂盒购自BD；0.125%胰蛋白酶、Hoechst 33258、PBS及兔抗GAPDH单克隆抗体和羊抗兔多克隆抗体均购自Bioswamp；兔抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)单克隆抗体、兔抗神经生长因子(nerve growth factor,NGF)多克隆抗体、兔抗PGC-1α多克隆抗体、兔抗Bcl-2多克隆抗体、兔抗Bax单克隆抗体、兔抗p53多克隆抗体、兔抗线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)多克隆抗体、兔抗DNA聚合酶γ(DNA polymerase gamma,POLG)单克隆抗体、兔抗ATP合酶O亚基(ATP synthase subunit O,ATP5O)多克隆抗体、兔抗细胞色素C氧化酶5b亚基(cytochrome C oxidase subunit 5b,COX5b)单克隆抗体、兔抗超氧化物歧化酶(super-oxide dismutase,SOD)1多克隆抗体和兔抗SOD2单克隆抗体均购自Abcam。

2 方法

2.1 细胞培养和处理 用含10% FBS的普通DMEM培养RGC-5细胞，细胞贴壁生长且密度达到90%后用0.125%胰蛋白酶消化，取传代后对数生长期的细胞用含不同浓度(10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L、25 mmol/L和30 mmol/L)葡萄糖、无FBS的DMEM培养基培养细胞24 h、48 h和72 h，采用MTT法检测细胞在不同浓度葡萄糖与不同作用时间条件下的活力，通过绘制浓度-时间生长曲线，选择最佳的葡萄糖浓度与时点，建立RGC-5细胞高糖模型。

2.2 载体构建 根据GenBank中小鼠PGC-1α的基因序列(NM_008904)，采用Primer 5 软件设计引物，上游引物序列为5’-CTAGCTAGCATGGCTTGGGA-CATGTGC-3’，下游引物序列为5’-CCGCTCGAGTTACCTGCGCAAGCTTCTC-3’，分别在引物的5’端添加XhoI和NheI的酶切位点，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。反应条件为: 94 ℃预变性3 min；94 ℃ 45 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，共31个循环；72 ℃再延伸5 min。扩增产物凝胶回收后，与真核表达质粒pcDNA-3.1分别进行XhoI和NheI双酶切，T4 DNA连接酶连接构建重组质粒pcDNA-3.1-PGC-1α，并转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，PCR初步鉴定，确定阳性质粒。

2.3 实验分组 取传代后处于对数生长期的细胞分为正常(normal)组、高糖(high glucose,HG)组、空载(empty vector, EV)组和PGC-1α过表达(PGC-1α)组，处理方法如下：正常组细胞使用普通DMEM培养基处理；高糖组、空载组和过表达PGC-1α组细胞使用最佳葡萄糖浓度的DMEM培养基处理；空载组细胞转染空载体；PGC-1α过表达组细胞转染pcDNA-3.1-PGC-1α重组质粒。

2.4 MTT实验检测细胞活力 将处于对数生长期的各组细胞分别接种于96孔板中(每孔1×106个细胞)，每孔100 μL，每组设3个复孔。各组细胞分别于培养24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，继续培养3～6 h，每孔加入100 μL甲臜溶解液孵育，在酶标仪上测定各孔吸光度(A)值，同一时点的A值取其3个复孔的平均值。

2.5 Hoechst 33258染色 分别收集各组细胞于6孔培养板中培养24 h，小心吸出培养基，4%多聚甲醛室温固定10 min，弃上清后于PBS中保存玻片。用0.2%的TritonX-100通透20～30 min后弃去培养液，用PBS洗涤玻片3次，加入Hoechst 33258染料，在含5% CO2的培养箱中37 ℃避光染色10 min，再用PBS避光洗涤玻片3次，干燥，封片，荧光显微镜观察，拍照保存。

2.6 流式细胞术检测各组细胞凋亡情况 将各组细胞分别接种在6孔培养板中培养24 h，弃去培养基并加入0.125%的胰蛋白酶消化，收集各组细胞，PBS洗涤2次后用PBS重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC染色液避光孵育10 min，再次离心并用PBS重悬细胞，加入5 μL PI染色液，利用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。

2.7 Western blot实验 采用RIPA法提取细胞总蛋白，BCA法进行蛋白定量。12% SDS-PAGE分离目的蛋白，湿转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入 I 抗4 ℃孵育过夜，PBST冲洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的特异性 II抗，室温孵育1 h，PBST冲洗3次，ECL试剂盒显影曝片。

3 统计学分析

本研究采用SPSS 19.0统计分析软件进行数据处理，实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用单因素方差分析进行多组间差异的比较，各组均数间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 MTT法筛选最佳葡萄糖浓度与作用时间

采用10、15、20、25和30 mmol/L浓度的葡萄糖处理细胞24 h、48 h和72 h后，MTT法检测结果(图1)显示，不同浓度的葡萄糖处理细胞24 h，对细胞活力的影响较小，因此选择24 h作为最佳作用时间。随着葡萄糖浓度的上升，细胞活力逐渐减弱，说明葡萄糖可抑制RGC-5细胞增殖，根据抑制程度，选择20 mmol/L葡萄糖作为最佳浓度。

Figure 1. Screening of glucose concentration and action time by MTT assay. Mean±SD.n=3.

图1 MTT法筛选最佳葡萄糖浓度与作用时间

2 过表达PGC-1α促进高糖刺激RGC-5细胞的活力

与正常组相比，高糖组细胞的活力显著减弱(P<0.05)；空载组和高糖组细胞活力之间的差异无统计学显著性(P>0.05);与空载组相比，PGC-1α过表达组细胞的活力显著增强(P<0.05)，见图2。

Figure 2. The cell viability was measured by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsEV group.

图2 MTT法检测细胞活力

3 过表达PGC-1α抑制高糖刺激的RGC-5细胞凋亡

Hoechst 33258染色和流式细胞术检测凋亡结果显示，正常组细胞核呈现椭圆形或圆形，其染色质呈较均匀蓝色，凋亡细胞较少；但高糖组和空载组凋亡细胞较多，且凋亡细胞核呈分叶状或点状，其染色质发生凝集并呈亮蓝色；PGC-1α过表达组凋亡细胞少于空载组，见图3A。

流式细胞术检测结果表明，高糖组和空载组细胞凋亡率较正常组显著增高(P<0.05)，PGC-1α过表达组细胞凋亡率较空载组显著降低(P<0.05)，但仍高于正常组(P<0.05),见图3B。

Western blot检测结果显示，与正常组相比，高糖组和空载组细胞Bax和p53蛋白的表达量显著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白的表达量显著降低(P<0.05)；与空载组相比，PGC-1α过表达组细胞Bax和p53蛋白的表达量显著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白的表达量显著升高(P<0.05)，见图4。

4 过表达PGC-1α对高糖刺激的RGC-5细胞氧化应激的影响

Western blot检测结果显示，与正常组相比，高糖组和空载组细胞NGF、VEGF、PGC-1α、TFAM、POLG、ATP5O、COX5b、SOD1和SOD2蛋白的表达量显著降低(P<0.05)；与空载组相比，PGC-1α过表达组细胞NGF、VEGF、PGC-1α、TFAM、POLG、ATP5O、COX5b、SOD1和SOD2蛋白的表达量显著升高(P<0.05),见图5。

Figure 3. Over-expression of PGC-1α inhibited apoptosis. A: the apoptosis was detected by Hoechst 33258 staining (×200); B: the apoptosis rate was analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsEV group.

图3 过表达PGC-1α抑制细胞凋亡

Figure 4. The expression of apoptosis-related proteins. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsEV group.

图4 凋亡相关蛋白表达的变化

Figure 5. The effects of PGC-1α over-expression on oxidative stress of RGC-5 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsEV group.

图5 过表达PGC-1α对高糖模型RGC-5细胞氧化应激的影响

讨 论

DR是糖尿病引发的一系列眼内并发症，是成年人致盲的重要原因之一，其具体发病机制尚未完全阐明。视网膜神经节细胞对高血糖介导的细胞凋亡具有高度敏感性，而视网膜感光细胞也是DR所致凋亡的主要细胞类型之一[6]。研究发现，在糖尿病动物模型中感光细胞凋亡增加[7]；在糖尿病患者中也扫描出光感受器层变薄现象[8]。感光细胞在DR早期的发展过程中发挥着被以往研究忽略了的重要作用[9]。

PGC-1α是一种强有力的线粒体和氧化代谢调节酶，在多种组织中均有表达。已经有研究证明它和视网膜血管的发生以及缺血状态时新生血管的形成密切相关[10]。此外，PGC-1α激酶还与光损伤下的光感受器存活相关[11]。耿慧霞等[12]的研究显示PGC-1α过表达可抑制氧糖剥夺/复氧诱导的神经元凋亡，抑制ROS的产生，促进线粒体生成和维护线粒体功能。有研究发现，高糖诱导的体外足细胞模型中PGC-1α表达显著下调，而PGC-1α表达下调导致细胞凋亡[13]。但PGC-1α对视网膜感光细胞的作用我们知之甚少。本研究结果表明过表达PGC-1α增强高糖模型RGC-5细胞的活力，抑制细胞凋亡，表明PGC-1α参与视网膜感光神经元病变，过表达PGC-1α可能是遏制DR恶化的关键靶点。NGF的生物学作用非常广泛，其参与视网膜细胞的分化、生长以及死亡，内源性NGF可沿轴突逆行至神经元发挥作用，也可以通过轴突顺行转运影响其远端的靶细胞，视网膜是高度分化的神经胶质细胞，对感光细胞、双极细胞及神经节细胞等起到营养、支持、绝缘和保护作用[14]。氧化应激损伤、ROS过度堆积、内源性抗氧化系统紊乱以及线粒体损伤是导致糖尿病引起视网膜病变的重要原因[15]。TFAM参与线粒体基因的表达、维持mtDNA的完整性以及mtDNA损伤的修复过程[16]。 POLG是迄今为止在线粒体中发现的唯一一种DNA聚合酶，它在mtDNA复制与修复过程中扮演着重要的角色[17]。线粒体参与多种生物学功能，可调节细胞增殖与凋亡。糖尿病可通过氧化应激损伤线粒体DNA及线粒体抗氧化防御系统[18]。杜月光等[19]研究发现，中药治疗促进糖尿病大鼠PGC-1α表达，降低了MDA含量，提高了SOD活性，从而减轻胰岛素抵抗、氧化应激及炎症反应。本研究结果也显示过表达PGC-1α可提高高糖模型RGC-5细胞NGF、VEGF、TFAM、POLG、ATP5O、COX5b、SOD1和SOD2蛋白的表达量，即过表达PGC-1α可对抗糖尿病引起的过氧化物堆积，减轻氧化应激及线粒体损伤，有效减缓DR的发展。

综上所述，过表达PGC-1α可提高高糖模型RGC-5细胞的活力，抑制其凋亡，减轻氧化应激及线粒体损伤，从而减缓DR的发展。