7-羟基异黄酮通过Id1影响结直肠癌细胞增殖*

陈慧菁, 廖锦容, 李洁羽, 叶韵斌

(福建省肿瘤医院， 福建医科大学附属肿瘤医院肿瘤免疫学研究室, 福建省肿瘤转化医学重点实验室， 福建 福州 350014)

结直肠癌是常见的恶性肿瘤，发病率已经位居我国恶性肿瘤发病率的第5位，近年来，结直肠癌的发病率趋向年轻化，发病有明显的性别差异性，青年女性的发病率低于同年龄段的男性，而女性绝经期后结直肠癌的发病率明显上升，略高于同年龄段的男性[1]。有不少相关报道表明雌激素可能在结直肠癌的发生发展中起重要的作用。

7-羟基异黄酮(7-hydroxyisoflavone，7-HIF)是一种植物类雌激素，为大豆异黄酮的代谢产物，与大豆异黄酮的主要成分3-羟基异黄酮结构类似。研究表明3-羟基异黄酮对于乳腺癌和黑色素瘤等多种肿瘤具有抗肿瘤作用[2-3]，其主要的作用机制包括抑制肿瘤细胞血管生成及蛋白酪氨酸激酶活性、诱导细胞的凋亡[4]等。但关于7-HIF是否具有抗肿瘤作用目前鲜有报道，7-HIF对肿瘤细胞的作用机制目前仍不清楚。

肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs) 是肿瘤组织中存在的、为数不多的具有自我更新能力、多分化潜能和无限增殖的细胞。肿瘤干细胞是肿瘤生长、侵袭、复发和转移的根源。分化抑制因子1(inhibitor of differentiation 1，Id1)是分化抑制因子家族成员，属于螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix，HLH)转录因子。本实验室的前期研究发现沉默人结直肠癌细胞HCT116中的Id1基因后细胞中干性相关分子的mRNA和蛋白表达水平均下降，提示Id1能够与结直肠癌细胞的干性特征相关[5]。有文献报道3-羟基异黄酮通过抑制Notch1/NF-κB/Slug/E-cadherin信号通路能逆转结直肠癌细胞干性，因此可作为潜在抑制肿瘤转移的药物[6]。与其结构相似的7-HIF是否也能通过Id1调控结直肠癌细胞的干性影响其生长? 因此本研究通过细胞实验观察7-HIF对结直肠癌细胞增殖的影响，并初步研究7-HIF是否通过Id1影响结直肠癌细胞的干细胞特性。

材 料 和 方 法

1 试剂

7-HIF系福建医科大学药学系陈翔飞博士惠赠;RPMI-1640 培养基、胎牛血清和胰酶均购自Gibco；Western blot裂解液和定量相关试剂购自碧云天生物试剂公司；WST-1试剂盒购自Roche；凋亡及细胞周期检测相关试剂购自BD；Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody和抗GAPDH抗体购自Cell Signaling；抗Id1抗体购自Santa Cruz；抗细胞周期蛋白(cyclin) D1、cyclin E、survivin、增殖细胞核抗原(prolife rating cell nuclear antigen, PCNA)、CD133、白细胞活化黏附因子(activated leukocyte cell adhesion molecule, ALCAM)和上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)抗体均购自Abcam。

2 方法

2.1 细胞培养 人结直肠癌细胞HCT116购自上海细胞库，用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基于5% CO2、37 ℃培养箱中培养。

2.2 WST-1法检测细胞活力 取对数生长期的HCT116细胞经胰酶消化后，调整细胞个数至每孔5×103，接种到96孔板，每孔做3个复孔，37 ℃、5% CO2培养12 h, 分别加入 0 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L和400 μmol/L的7-HIF继续培养48 h，弃培养液，加入10 μL WST-1工作液，37 ℃、5% CO2培养箱孵育2 h，酶标仪测490 nm处吸光度(A)值。

2.3 集落形成实验 胰酶消化后的HCT116细胞，按每孔1 500个细胞(2 mL)接种到6孔板中，24 h后换液加入200 μmol/L 7-HIF，每隔3～4 d补充新鲜培养液，10 d后弃培养液，PBS洗涤2次，甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染液染色，显微镜下观察超过50个细胞为1个克隆，计算集落数。

2.4 流式细胞术检测细胞周期 HCT116细胞消化后调整密度至4×108/L，接种于6孔板，5%CO2培养18 h贴壁后, 同步化处理(无血清培养 24 h)后，换液加入含 10%FBS 的培养液及200 μmol/L的7-HIF培养24 h，收集细胞，PBS洗涤后按试剂盒说明书分别依次加入相应的细胞周期相关试剂，避光孵育10 min，用50 μm的尼龙膜过滤，上机检测。

2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 HCT116细胞按2.4操作，PBS洗涤后加入Binding Buffer 重悬细胞，加入Annexin V-FITC混匀后，再加入PI，避光室温孵育10 min, 用50 μm的尼龙膜过滤，上机检测。

2.6 Western blot实验 收集细胞，加入裂解液提取蛋白，BCA法进行蛋白浓度测定，40 μg总蛋白等量上样，10%SDS-PAGE分离蛋白，湿法转至 PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h， I 抗用5%脱脂奶粉11 000稀释，4 ℃孵育过夜， 用 缓冲液TBST漂3次，然后加入 II 抗室温下孵育1 h，荧光发光试剂显影后使用图像成像系统检测条带。

3 统计学处理

使用SPSS 16.0统计软件进行数据处理和统计分析。数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，两两比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 7-HIF抑制结肠癌细胞HCT116活力

WST-1法检测细胞的活力，结果显示，与对照组相比，药物浓度为200 μmol/L和400 μmol/L时细胞的生长受到明显抑制(P<0.05),见图1。

Figure 1. WST-1 assay was used to measure the cell viability after exposure to 7-HIF. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

图1 不同浓度的7-HIF对HCT116细胞活力的影响

2 7-HIF抑制结肠癌细胞HCT116克隆形成

从生长曲线可知当药物浓度为200 μmol/L时，HCT116细胞的生长受到明显抑制，因此在后续的实验中我们均采用200 μmol/L的浓度。集落形成实验进一步验证7-HIF对HCT116细胞增殖的影响。结果显示7-HIF作用10 d 后的HCT116细胞的集落形成的数目及大小均较未处理组明显减少(P<0.05)，见图2。

Figure 2. The colony formation ability of HCT116 cells after exposure to 200 μmol/L 7-HIF. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图2 集落形成实验验证7-HIF对HCT116细胞增殖的影响

3 7-HIF对结肠癌细胞HCT116细胞周期的影响

结果显示与对照组相比，200 μmol/L 7-HIF处理后的HCT116细胞周期G0/G1期的比例显著升高(P<0.05)，而S期的比例显著下降(P<0.05)，提示7-HIF能使HCT116细胞阻滞于G0/G1期，从而抑制细胞的生长，见图3A。7-HIF处理后细胞周期蛋白cyclin D1、cyclin E、凋亡抑制因子survivin和PCNA表达较对照组均明显下降(P<0.05)，见图3B。提示7-HIF可能是通过抑制HCT116细胞周期相关蛋白和增殖相关蛋白的表达从而抑制了细胞的增殖。

Figure 3. 7-HIF induced cell cycle arrest at G0/G1phase and blocked the expression of proliferation-related protein in the HCT116 cells. A: HCT116 cells were treated with 7-HIF at 200 μmol/L for 24 h and the cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry; B: the effect of 7-HIF on the expression of proliferation-related proteins in the HCT116 cells determined was by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图3 7-HIF对HCT116细胞周期及相关增殖蛋白的影响

4 7-HIF诱导HCT116细胞凋亡

流式细胞术检测7-HIF(200 μmol/L)处理48 h后的HCT116细胞的凋亡率显示：7-HIF处理组的HCT116细胞凋亡率较对照组明显增高(P<0.05)，见图4。

5 7-HIF影响HCT116细胞干性相关蛋白的表达

7-HIF处理后HCT116细胞干性相关蛋白CD133、ALCAM和EpCAM的表达较对照组明显降低(P<0.05),见图5。提示7-HIF能抑制HCT116细胞的干性。

6 7-HIF下调HCT116细胞中Id1的表达

Western blot实验结果显示，给予200 μmol/L 7-HIF处理48 h后，HCT116细胞中Id1的蛋白表达水平较对照组降低(P<0.05)，见图6。表明7-HIF能抑制HCT116细胞中Id1的表达。

Figure 4. The effect of 7-HIF on the apoptosis of HCT116 cells was analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图4 7-HIF对HCT116细胞凋亡的影响

Figure 5. The effect of 7-HIF on the expression of stemness related proteins in the HCT116 cells was detected by Western blot. GAPDH served as an internal control. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图5 Western blot法检测7-HIF对HCT116细胞干性相关蛋白的影响

讨 论

研究表明，雌激素与大肠癌存在密切关系，上个世纪70年代流行病学研究表明，大肠癌与乳腺癌具有相似的流行病学特点，提示雌激素可能是大肠癌的致病因素之一[7]。随着研究的深入，关于雌激素究竟具有促进肿瘤还是抑制肿瘤的作用仍然存在争议。流行病学的研究发现，在一些经常食用大豆的国家里，结肠癌的发病率较低[8];Meta分析显示，大豆异黄酮的摄入能显著的降低女性大肠癌的发病风险[9];另有学者研究发现，年龄大于56岁的妇女使用雌激素，结直肠肠癌的发病率比未使用者明显降低，提示适量雌激素可能抑制结直肠癌肿瘤的生长[10]。

大豆异黄酮是目前应用最广的植物雌激素，其化学结构与雌激素类似，3-羟基异黄酮是其中最主要的有效成分。研究证实，3-羟基异黄酮能活化雌激素受体β,通过雌激素受体β选择性激活促凋亡信号发挥抗肿瘤效应，抑制炎症肿瘤微环境的信号[11]。雌激素受体β在大肠组织中可能发挥抑癌基因作用，在防止大肠黏膜细胞恶变，抑制癌细胞增殖的同时促进肠癌细胞凋亡[12]。7-HIF作为大豆异黄酮的代谢产物，与3-羟基异黄酮结构类似，在研究中我们发现7-HIF能抑制结肠癌细胞HCT116的生长，使其细胞周期阻滞于G0/G1期。进一步对细胞周期相关蛋白进行检测，结果显示7-HIF能降低细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin E的表达，同时能降低增殖相关蛋白survivin和PCNA的表达，提示7-羟基异黄酮通过抑制细胞周期蛋白及增殖相关的表达而使肠癌细胞处于静止的状态，从而抑制肠癌细胞的生长。由于肿瘤发生是肿瘤细胞增殖和凋亡平衡失调的结果，进一步的凋亡研究表明7-HIF作用后能使肠癌细胞的凋亡率明显上升，提示7-HIF可能通过抑制结直肠癌细胞的生长和促进其凋亡发挥抗肿瘤作用。

复发和转移是结直肠癌患者死亡的主要原因。肿瘤干细胞学说认为肿瘤干细胞是肿瘤复发和转移的根源。肿瘤干细胞具有自我更新能力，无限增殖的潜能，增强侵袭和转移能力[13]、抗常规放疗和化疗的能力，这些可能是肿瘤治疗失败的主要原因[14]。鉴定肿瘤干细胞最权威的方法之一是筛选确定肿瘤干细胞的细胞表面标志物。目前比较确定的结直肠癌干细胞标志物主要有EpCAM、ALCAM、CD133、CD44、CD24和CD166等[15]。Id1是分化抑制因子家族成员，其生物学功能是对抗分化转录因子而让细胞停留在未分化的状态，具有维持其自我更新的功能。研究发现雌激素能影响Id1的表达，Schoppmann 等[16]在191例乳腺癌组织中发现Id1的高表达与孕激素受体的表达量呈负相关,提示激素疗法可能会影响Id1的表达;Jang等[17]对263例乳腺癌组织标本分析发现Id1高表达与雌激素受体阴性和结节型乳腺癌以及微血管密度明显相关，这些均提示在乳腺癌中雌激素能影响Id1的表达。本实验室前期研究也发现在HCT116细胞中Id1呈高表达状态，小干扰RNA沉默Id1后其增殖活性和克隆形成能力明显下降，结直肠癌干细胞标志物CD24、CD44、CD133、CD166和EpCAM的mRNA和蛋白表达水平均明显下降[5]，提示在结直肠癌中Id1的表达与肿瘤的增殖、干性密切相关。本研究结果显示7-HIF能抑制结肠癌细胞的生长、增殖，促进其凋亡。7-HIF作用于HCT116细胞能降低Id1蛋白表达的水平，同时7-HIF能明显降低结肠癌细胞干性相关标志物CD133、ALCAM和EpCAM的表达，提示7-HIF可能是通过下调Id1影响了HCT116细胞的干性，从而影响了HCT116细胞的生长和增殖。

Figure 6. The protein expression of Id1 was reduced by treating with 200 μmol/L 7-HIF. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图6 7-HIF对HCT116细胞Id1表达的影响