miR-125a-5p靶向LIMK1逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞对顺铂的耐药性*

刘勇志， 张 童， 沈 毅， 邓 爽

[核工业四一六医院(成都医学院第二附属医院)胸外科， 四川 成都 610000]

非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)属于世界高发的恶性肿瘤之一，以手术治疗、放疗和化疗为主要治疗手段[1]。然而NSCLC早期症状不明显，患者就诊时多数已是晚期，此时化疗是唯一有效的治疗方式[2]。顺铂(cisplatin，DDP)是化疗中常用的化学药物，能够阻碍DNA复制，影响细胞周期，从而诱导NSCLC细胞凋亡，抑制肿瘤生长[3-4]。但长期使用易使肿瘤细胞产生耐药性，影响治疗效果。因此，寻找克服肿瘤细胞耐药性的方法，对改善NSCLC的治疗具有重要意义。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一种高度保守的非编码RNA序列，广泛存在于生物体内，参与细胞增殖、分化和凋亡等生物过程，与肿瘤的发生发展及肿瘤细胞的耐药性密切相关[5-6]。已有多项研究表明，miRNA在胃癌[7]和卵巢癌[8]等多种肿瘤中差异表达，调控癌细胞增殖和凋亡并影响细胞耐药性。其中，miR-125a-5p与多种肿瘤的化疗耐药性有关[9-10]，但其在NSCLC化疗耐药中的作用机制尚未报道。本文以A549/DDP细胞为研究对象，通过检测miR-125a-5p对细胞活力及凋亡的影响并预测其潜在靶基因，探讨miR-125a-5p影响A549/DDP细胞顺铂耐药性的作用机制。

材 料 和 方 法

1 临床资料

选取2015年3月～2017年12月就诊于核工业四一六医院(成都医学院第二附属医院)经病理科确诊为非小细胞肺癌的患者共52例，其中男性33例，女性19例，年龄45～81岁，收集患者经手术切除的肿瘤组织及对应的癌旁组织(距离病灶≥5 cm)，所有组织切除迅速放入液氮中，带回后存放于-80 ℃ 冰箱。本实验获得医学伦理委员会审批同意，所有患者术前未接受放疗、化疗等相关治疗并签署知情同意书。

2 材料

人支气管上皮细胞株16-HBE和非小细胞肺癌细胞株A549购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库；顺铂耐药细胞株A549/DDP购自中国医学科学院肿瘤细胞库。胎牛血清、RPMI-1640培养基、胰蛋白酶和DDP购自Sigma；MTT和Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自赛默飞世尔科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒和SDS-PAGE 试剂盒购自江苏碧云天生物技术公司；TRIzol试剂购自北京天根生化科技有限公司；LipofectamineTM2000购自Invitrogen；TaKaRa反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购自TaKaRa；miR-125a-5p mimics、miR-125a-5p inhibitor、mimics NC、inhibitor NC、si-NC和si-LIMK1购自Invitrogen； I 抗和II 抗购自Abcam；萤光素酶载体购自Promega。

3 方法

3.1 细胞培养及转染 使用含10% 胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI-1640培养基于37 ℃、5% CO2条件下常规培养，其中A549/DDP细胞培养基中含终浓度1 mg/L的DDP，每隔2 d更换1次新鲜培养基，细胞融合度约85% 时进行传代。收集对数生长期的细胞，加入适量胰酶消化，接种至6孔培养板常规培养。待细胞生长至融合度约50%，参照LipofectamineTM2000转染试剂说明书将mimics NC、miR-125a-5p mimics、inhibitor NC、miR-125a-5p inhibitor、si-NC和si-LIMK1分别转染至A549/DDP细胞并标记为mimics-NC组、mimics-miR-125组、inhibitor-NC组、inhibitor-miR-125组、si-NC组和si-LIMK1组。

3.2 RT-qPCR检测miR-125a-5p表达 适量组织或细胞充分研磨后，加入TRIzol试剂提取总RNA。使用TaKaRa反转录试剂盒进行反转录，TaKaRa荧光定量试剂盒配制反应体系，置于实时荧光定量PCR仪上进行扩增。以β-actin为内参照，所用引物及序列见表1，mRNA相对表达量用2-ΔΔCt表示。

表1 RT-qPCR引物序列

3.3 MTT法检测细胞活力及DDP的半数抑制浓度(IC50) 收集转染的A549/DDP细胞和常规培养的A549细胞，加入适量胰酶消化，以每孔2×104个的密度接种于96孔板中常规培养，分别在培养0 h、24 h、48 h和72 h时加入20 μL MTT(5 g/L)，继续培养4 h，吸出培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，室温振荡反应10 min，使用酶标仪测定490 nm的吸光度(A)值。细胞存活率(%)=(对照组A值-实验组A值)÷实验组A值×100%。药物对细胞的抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%，计算IC50值。

3.4 流式细胞术检测细胞凋亡 转染的A549/DDP细胞培养72 h后，使用PBS缓冲液洗涤3次，胰酶消化后离心收集。加入500 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，分别加入Annexin V-FITC和碘化丙啶，染色20 min后使用流式细胞仪检测细胞凋亡。

3.5 Western blot实验 收集转染的A549/DDP细胞，加入细胞裂解液裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min取上清，BCA试剂盒测定蛋白浓度。取50 μg蛋白样品进行SDS-PAGE，电泳结束后将蛋白转至PVDG膜，5% 脱脂奶粉封闭液封闭1 h，分别加入 I 抗4 ℃ 孵育过夜，TBST洗膜后加入 II 抗孵育1 h。TBST洗膜后ECL发光显影。

3.6 萤光素酶报告基因检测 收集A549/DDP细胞，按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书将LIMK1-3’UTR野生型质粒与mimics NC和miR-125a-5p mimics共转染，将LIMK1-3’UTR突变型质粒与mimics NC和miR-125a-5p mimics共转染，常规培养48 h。裂解液裂解后4 ℃、 12 000 r/min离心10 min收集上清，检测细胞中萤光素酶活性。

4 数据处理及统计学分析

实验中每个样本重复3次， 运用SPSS 17.0对数据进行统计分析。计量资料正态分布数据采用均数±标准差(mean±SD)进行描述，两组数据比较采用t检验，多组数据总体比较采用单因素方差分析，总体有差异再用SNK-q检验进行多重比较。偏态数据采用中位数(下四分位数，上四分位数)[median (Q1,Q3)]描述，两组数据比较采用Mann-WhitneyU检验,多组数据比较采用Kruskal-WallisH检验,发现差异再用Nemenyi法进行多重比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 miR-125a-5p在非小细胞肺癌组织和细胞中的表达

MTT法检测细胞活力发现，A549/DDP细胞活力明显高于A549细胞(P<0.05)，见图1A，提示A549/DDP细胞具有DDP耐药性。RT-qPCR检测结果表明，与癌旁组织相比，miR-125a-5p在非小细胞肺癌组织中表达下调(P<0.05)，见图1B；与16-HBE细胞相比，A549细胞和A549/DDP细胞中miR-125a-5p表达均显著下调(P<0.05)，见图1C。

Figure 1. The expression of miR-125a-5p in the non-small-cell lung cancer (NSCLC) tissues and cells. A: the viability of A549 and A549/DDP cells was detected by MTT assay. Mean±SD.n=3. B: the expression of miR-125a-5p in the paracancerous (PC) and NSCLC tissues. Median (Q1,Q3).n=52. C: the expression of miR-125a-5p in various cell lines. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA549 cells;#P<0.05vsPC group;△P<0.05vs16-HBE cells.

图1 miR-125a-5p在非小细胞肺癌组织和细胞中的表达

2 过表达miR-125a-5p降低A549/DDP细胞耐药性

与control组和mimics-NC组相比，转染miR-125a-5p mimics的A549/DDP细胞中miR-125a-5p的表达上调(P<0.05)，细胞活力下降(P<0.05)，细胞凋亡率增加(P<0.05)，DDP对细胞的IC50值减小(P<0.05)，耐药相关蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)和谷胱甘肽S-转移酶π(glutathioneS-transfe-rase π, GST-π)蛋白表达下调(P<0.05)，见图2。

3 抑制miR-125a-5p表达提高A549/DDP细胞耐药性

与control组和inhibitor-NC组相比，转染miR-125a-5p抑制剂的A549/DDP细胞中miR-125a-5p的表达下调(P<0.05)，细胞活力升高(P<0.05)，细胞凋亡率降低(P<0.05)，DDP对细胞的IC50值增大(P<0.05)，P-gp和GST-π的表达上调(P<0.05)，见图3。

Figure 2. Up-regulation of miR-125a-5p inhibited the drug resistance of A549/DDP cells. A: the expression of miR-125a-5p in va-rious groups; B: the cell viability in various groups; C: the apoptotic rate in various groups; D: IC50values of DDP in va-rious groups; E: the protein expression of P-gp and GST-π. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group and mimics-NC group.

图2 过表达miR-125a-5p降低A549/DDP细胞耐药性

Figure 3. Inhibition of miR-125a-5p enhanced the drug resistance of A549/DDP cells. A: the expression of miR-125a-5p in various groups; B: the cell viability in various groups; C: the apoptotic rate in various groups; D: IC50values of DDP in various groups; E: the protein expression of P-gp and GST-π. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group and inhibitor-NC group.

图3 抑制miR-125a-5p提高A549/DDP细胞耐药性

4 LIMK1是miR-125a-5p的靶基因

过表达miR-125a-5p的A549/DDP细胞中LIMK1的表达较mimics-NC组下调(P<0.05)；敲减miR-125a-5p表达的A549/DDP细胞中LIMK1的表达较inhibitor-NC组上调(P<0.05)，证明miR-125a-5p能够调控LIMK1表达，见图4A、B。通过TargetScan在线预测，发现LIMK1-3’UTR上存在miR-125a-5p的结合位点，见图4C。进一步使用萤光素酶报告基因实验验证miR-125a-5p和LIMK1的靶向性，发现与mimics-NC组相比，转染miR125a-5p模拟物的LIMK1野生型细胞的萤光素酶活性降低(P<0.05)，而LIMK1突变型细胞的萤光素酶活性无明显变化，见图4D，表明LIMK1是miR-125a-5p的靶基因。miR-125a-5p与LIMK1表达呈负相关(r=-0.7823，P<0.01)，见图4E。

Figure 4. miR-125a-5p regulated the expression of LIMK1. A: the mRNA expression of LIMK1 in various groups; B: the protein expression of LIMK1 in various groups; C: the complementary sequences of miR-125a-5p and LIMK1; D: the result of dual-luciferase assay; E: the negative correlation between miR-125a-5p and LIMK1. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimics-NC group;#P<0.05vsinhibitor-NC group.

图4 miR-125a-5p靶向调控LIMK1表达

5 敲减LIMK1表达降低A549/DDP细胞对DDP的耐药性并诱导细胞凋亡

对比癌旁组织，NSCLC组织中LIMK1表达上调(P<0.05)，见图5A；A549细胞和A549/DDP细胞中LIMK1的表达较16-HBE细胞上调(P<0.05)，见图5B。与control组和si-NC组相比，敲减LIMK1表达后A549/DDP细胞中的LIMK1表达下调(P<0.05)，细胞活力下降(P<0.05)，细胞凋亡率升高(P<0.05)，DDP对细胞的IC50值减小(P<0.05)，P-gp和GST-π 蛋白的表达下调(P<0.05)，见图5C～G。

Figure 5. Silencing ofLIMK1inhibited A549/DDP cell resistance to DDP and induced apoptosis. A: the expression of LIMK1 in paracancerous (PC) and NSCLC tissues [median (Q1,Q2),n=52]; B: the expression of LIMK1 in different cell lines; C: the protein expression of LIMK1 in various groups; D: the cell viability in various groups; E: the apoptosis in various groups; F: IC50values of DDP in various groups; G: the protein expression of P-gp and GST-π in various groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsPC group;#P<0.05vs16-HEB cells;△P<0.05vscontrol group and si-NC group.

图5 敲减LIMK1表达降低A549/DDP细胞对DDP的耐药性并诱导细胞凋亡

6 过表达LIMK1能逆转miR-125a-5p降低A549/DDP细胞对DDP的耐药性并诱导凋亡的作用

MTT法检测细胞活力，结果显示，LIMK1组较vector组细胞活力升高(P<0.05)，mimics-miR-125+LIMK1组较mimics-miR-125+vector组细胞活力升高(P<0.05)，见图6A。进一步检测细胞凋亡率、DDP的IC50值及P-gp和GST-π蛋白表达，结果显示，与vector组或mimics-miR-125+vector组相比，过表达LIMK1或共表达miR-125a-5p和LIMK1，A549/DDP细胞凋亡率降低(P<0.05)，DDP对细胞的IC50值增大(P<0.05)，P-gp和GST-π 蛋白的表达上调(P<0.05)，见图6B～D。

讨 论

化疗是晚期NSCLC患者延长寿命、改善生活质量的希望,其中顺铂已被广泛应用于肿瘤的临床治疗，然而治疗过程中癌细胞对顺铂耐药性的产生限制了顺铂的疗效[11]。已有报道表明，miRNA可通过调节细胞周期和凋亡影响NSCLC细胞对顺铂的敏感性[12]。Li等[13]研究发现，抑制miR-196a表达可逆转A549/DDP细胞的顺铂耐药性；此外，Zhang等[14]通过实验证明，miR-181c能够通过靶向调控WIF-1表达增强癌细胞顺铂抗性。

miR-125a-5p在胰腺癌、宫颈癌和胃癌等多种肿瘤组织中差异表达，影响肿瘤细胞增殖、凋亡和迁移，具有抑癌因子的作用[15-17]；在NSCLC组织中miR-125a-5p表达下调并调控癌细胞的迁移和侵袭[18]。随着不断的研究，发现miR-125a-5p不仅能影响肿瘤细胞生长和迁移，对肿瘤细胞在化疗中产生的耐药性也有一定影响，但相关研究较少。Naidu等[10]发现在NSCLC中，miR-125a-5p能通过靶向调控KRAS等肿瘤基因而增强癌细胞药物敏感性。为探讨miR-125a-5p对NSCLC顺铂耐药性的影响及作用机制，本文通过检测miR-125a-5p在NSCLC组织和细胞中的表达及其对A549/DDP细胞凋亡和耐药蛋白表达的影响，发现miR-125a-5p在NSCLC组织及细胞株中表达下调，过表达miR-125a-5p能抑制A549/DDP细胞中耐药P-gp和GST-π蛋白表达，降低细胞活力，促进细胞凋亡并使IC50值减小；抑制miR-125a-5p表达则得到相反的结果，表明miR-125a-5p能够影响A549/DDP细胞顺铂耐药性。通过TargetScan在线预测及萤光素酶报告基因实验，结果显示miR-125a-5p能靶向调控LIMK1表达，两者呈负相关。

Figure 6. Over-expression of LIMK1 reversed the effects of miR-125a-5p on the drug resistance and apoptosis of A549/DDP cells. A: the cell viability in various groups; B: the apoptosis in various groups; C: IC50values of DDP in various groups; D: the results of Western blot for determining the protein levels of P-gp and GST-π in various groups. Mean±SD.n=3.#P<0.05vsvector group;*P<0.05vsmimics-miR-125+vector group.

图6 过表达LIMK1能逆转miR-125a-5p降低A549/DDP细胞耐药性并诱导凋亡的作用

LIMK1属于LIM激酶(LIM kinase，LIMK)蛋白家族，能够使肌动蛋白结合蛋白cofilin磷酸化而调控细胞的有丝分裂、迁移和侵袭[19]。在乳腺癌和非小细胞肺癌组织中，LIMK1表达显著上调，促进癌细胞迁移和侵袭[20-21]。为进一步研究LIMK1与肿瘤细胞耐药性是否相关，陈瑞等[22]研究发现，上调LIMK1表达能增强人骨肉瘤细胞的耐药性。并且在NSCLC细胞顺铂耐药性的研究中，Chen等[23]发现，敲低LIMK1能降低肺癌细胞对顺铂的敏感性。为进一步验证miR-125a-5p与LIMK1在NSCLC细胞耐药性中的共同作用，我们使用RT-qPCR和Western blot实验进行检测，结果表明LIMK1在NSCLC及其细胞株中表达上调。敲减LIMK1表达能够抑制A549/DDP细胞活力并诱导凋亡，使IC50值减小，抑制耐药相关蛋白P-gp和GST-π的表达，与上述结论一致；而共表达miR-125a-5p和LIMK1，则miR-125a-5p对A549/DDP细胞活力及P-gp和GST-π蛋白表达的抑制作用减弱，对细胞凋亡的诱导作用亦减弱，DDP的IC50值回升。

综上所述，在NSCLC组织及其细胞株中，miR-125a-5p表达下调而LIMK1表达上调，LIMK1是miR-125a-5p的靶基因，且miR-125a-5p可靶向LIMK1而逆转肺癌A549/DDP细胞对顺铂的耐药性。这一结论补充了NSCLC顺铂耐药的机制，为寻找克服NSCLC顺铂耐药性的新方案提供可能途径。