异丙酚通过TRPV1离子通道抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症反应

黄伯万， 黄 强， 姜远旭△

(1 湛江中心人民医院麻醉科， 广东 湛江 524037； 2暨南大学第二临床医学院/深圳市人民医院麻醉科， 深圳市麻醉医学工程研究中心， 广东 深圳 518020)

在外科手术过程中，手术创伤导致的炎症反应，以及患者血压下降导致的急性脑缺血/缺氧，均可诱发神经炎症反应以及神经细胞受损[1-2]。小胶质细胞作为中枢神经系统固有免疫细胞，在宿主防御和组织修复方面起重要作用[3]。生理条件下，小胶质细胞常处于静止状态。当脑部缺血/缺氧、炎症和感染时，小胶质细胞迅速变为活化状态，产生释放大量的促炎细胞因子，破坏神经细胞和血脑屏障[4-5]。

异丙酚(propofol,P)是一种短效静脉麻醉药，具有作用迅速和维持时间短的优点，临床上广泛用于全身麻醉和ICU镇静[6]。Propofol对神经系统具有良好的抗炎作用[7]，但具体机制仍不清楚。瞬时受体电位阳离子通道V亚族成员1(transient receptor potential cation channel subfamily V member 1, TRPV1)是一种非选择性阳离子通道[8]。研究表明，TRPV1是小胶质细胞多种激活途径的关键调节因子，对调节神经炎症有重要的作用[9-11]。本项工作参照以往研究[12-13]，拟建立脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的BV2小胶质细胞模拟外科手术过程中的神经炎症反应，探讨propofol抗神经炎症的作用机制，为propofol在手术中用于预防神经炎症提供参考资料。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 细胞株 小鼠小胶质细胞BV2购自中国科学院上海细胞库，由暨南大学医学院提供。

1.2 药物和试剂 Propofol购自Fresenius Kabi AB；lipopolysaccharide购自Sigma；TRPV1抑制剂AMG517购自Selleck；肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) ELISA试剂盒购自RayBiotech；抗白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、TNF-α、TRPV1、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(calcium/calmodulin-dependent protein kinase II, CaMKII)、p-CaMKII和β-actin抗体购自Cell Signaling Technology；Fluo-3 AM购自中国碧云天公司；TRPV1和β-actin引物由中国上海英潍捷基合成提供。

2 方法

2.1 细胞培养 BV2细胞在温度为37 ℃、5% CO2、相对湿度95%的细胞培养箱中用含10% 胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液培养。每日在倒置显微镜下观察细胞状态，细胞隔天换液 1 次， 细胞覆盖培养瓶80%～90% 左右时进行传代。

2.2 细胞干预 取处于对数生长期细胞，在倒置显微镜下观察，待细胞生长至80%～90%时加入0.25%含EDTA的胰酶消化，重悬细胞，进行实验。实验分为4组：空白对照(control, C)组、单独LPS处理(L)组、L+P组和LPS+AMG517(L+A)组。L组在不含血清的培养液中加入LPS(100 μg/L)处理4 h；L+P组和L+A组分别用propofol(100 μmol/L)和AMG517(0.6 μmol/L)预处理1 h，随后加入LPS(100 μg/L)处理4 h。另设单独propofol处理组：在不含血清的培养液中加入propofol(100 μmol/L)处理4 h。按实验需求收集细胞。上述药物剂量严格参照以往的研究[14-16]。

2.3 ELISA检测 在相应的时点收集处理后的细胞培养液，严格按试剂盒说明操作，检测TNF-α含量的变化。

2.4 Real-time PCR TRIzol收集细胞于1.5 mL EP管中，冰上裂解 5 min，加0.2 mL氯仿，涡旋振荡混匀；4 ℃、12 000×g离心 5 min; 转上层水相(约400 μL) 于另一1.5 mL EP 管中；加入等体积异丙醇，振荡混匀；4 ℃、12 000×g离心 10 min；弃上清，加入预冷的 75% 乙醇 1 mL；4 ℃、12 000×g离心 5 min; 弃上清， 加无水乙醇 1 mL；4 ℃、 12 000×g离心 5 min; 弃上清， 空气干燥5～10 min; 溶于 40 μL DEPC水中，使用 NanoDrop 2000 超微量核酸蛋白测定仪检测 RNA 浓度并校准， 按逆转录试剂盒说明书步骤进行逆转录。Real-time PCR步骤严格按照TaKaRa说明书操作，应用 2-ΔΔCt方法计算。β-actin的正向引物序列为5’-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3’,反向引物序列为5’-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC-3’; TRPV1的正向引物序列为5’-CCGGCTTTTTGGGAAGGGT-3’，反向引物序列为5’-GAGACAGGTAGGTCCATCCAC-3’。

2.5 Western blot 在相应的时点收集细胞用蛋白裂解液裂解细胞，冰上裂解 5 min，4 ℃、12 000×g离心 10 min；提取的细胞蛋白用 BCA 法测定蛋白浓度。配制凝胶，12%分离胶，5% 浓缩胶; 上样量 50 μg，120 V恒压电泳，结束后取出凝胶，和相同大小的PVDF置于3层滤纸中间，放入转移槽中，加满转膜液，恒压100 V电转约90 min。取出PVDF膜，浸泡于TBST中5 min；放入 5% 脱脂奶粉中封闭，室温下1 h；TBST 洗3次，每次 10 min， 加 I 抗， 4 ℃过夜； TBST 洗 3 次，每次 10 min; 加 II 抗，室温下1 h; TBST 洗 3 次， 每次 10 min，暗房曝光，并使用 ImageJ 统计条带强度。

2.6 细胞内Ca2+浓度检测 用0.25%含EDTA的胰酶消化处理后的细胞于流式管中，500×g离心 5 min，弃上清，用PBS洗涤2次，加入100 μL Fluo-3 AM(5 μmol/L)室温避光重悬浮30 min，然后加入PBS终止染色，500×g离心5 min，弃上清，加入500 μL PBS重悬。应用流式细胞仪在488 nm激发波长下检测。

3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件分析。数据用均数±标准差(mean±SD)表示。组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Propofol对LPS诱导的小胶质细胞分泌TNF-α的影响

与C组相比，L组TNF-α水平显著升高(P<0.01)，表明造模成功；与C组相比，单独propofol处理TNF-α水平的差异无统计学显著性；与L组相比，propofol预处理1 h和与LPS共同处理在4 h内TNF-α的水平均能显著降低(P<0.01)；与L组相比，propofol与LPS共同处理6 h，TNF-α水平的差异无统计学显著性，见图1。

Figure 1. Effect of propofol on LPS-stimulated TNF-α production. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsC group;**P<0.01vsL group.

图1 Propofol对LPS诱导的小胶质细胞分泌TNF-α的影响

2 Propofol对小胶质细胞TRPV1 mRNA表达的影响

与C组相比，L组TRPV1 mRNA表达显著上调(P<0.01)；与L组相比，L+P组TRPV1 mRNA表达显著下调(P<0.01),见图2。

Figure 2. Expression of LPS-stimulated TRPV1 mRNA. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsC group;**P<0.01vsL group.

图2 Propofol对小胶质细胞TRPV1 mRNA表达的影响

3 Propofol和AMG517对小胶质细胞促炎细胞因子和TRPV1蛋白表达的影响

与C组相比，L组TNF-α、IL-6和IL-1β和TRPV1的蛋白表达均显著上调(P<0.01)；与L组相比，L+P组和L+A组TNF-α、IL-6、IL-1β和TRPV1的蛋白表达均显著下调(P<0.01)，见图3。

Figure 3. Effects of propofol or AMG517 (0.6 μmol/L) on LPS-stimulated TRPV1, TNF-α, IL-1β and IL-6 protein expression. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsC group;**P<0.01vsL group.

图3 Propofol和AMG517对小胶质细胞促炎细胞因子和TRPV1蛋白表达的影响

4 Propofol和AMG517对小胶质细胞内Ca2+浓度的影响

与C组相比，L组Ca2+浓度显著升高(P<0.05)；与L组相比，L+P组和L+A组Ca2+浓度显著降低(P<0.01)，见图4。

Figure 4. Effects of propofol or AMG517 (0.6 μmol/L) on LPS-stimulated intracellular Ca2+concentration. Mean±SD.n=3.#P<0.05vsC group;**P<0.01vsL group.

图4 Propofol和AMG517对小胶质细胞内Ca2+浓度的影响

5 Propofol和AMG517对小胶质细胞p-CaMKII的影响

与C组相比，L组p-CaMKII的蛋白表达显著上调(P<0.01)；与L组相比，L+P组和L+A组p-CaMKII的蛋白表达显著下调(P<0.01)，见图5。

讨 论

在外科手术围术期，神经炎症反应较为常见，如不能有效干预，术后可导致脑损伤[1]。小胶质细胞是中枢神经系统中的一类巨噬细胞，可分为M1和M2 2种类型。M1型主要发挥促炎功能，可分泌炎性因子如TNF-α和IL-6等，引发炎症反应，具有显著的神经毒性作用，BV2小胶质细胞用于体外神经炎症研究已被广泛使用[3,17]。神经炎症的特征之一是小胶质细胞的激活，它的持续激活会促进多种促炎细胞因子的产生和释放(如TNF-α、IL-1β和IL-6)，可能导致神经细胞损伤，从而诱发神经退行性疾病如阿尔茨海默症、帕金森症等疾病[18]。LPS是经典的炎症模型诱导药物[19]，当细胞受到LPS刺激后，NF-κB从NF-κB-IκB 复合物中解离并转移至细胞核，激活细胞内多条信号转导通路，从而启动炎症介质的表达如TNF-α、IL-1β和IL-6[20]。因此，在本研究，我们通过使用LPS处理BV2小胶质细胞构建体外神经炎症模型，评估propofol在小胶质细胞激活中的作用。

Figure 5. Effects of propofol on LPS-induced phosphorylation of CaMKII. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsC group;**P<0.01vsL group.

图5 Propofol和AMG517对小胶质细胞p-CaMKII的影响

既往研究显示，propofol通过抑制炎性因子的表达，减少炎性因子、粒细胞在脑组织的浸润和活化，来减轻脑组织的损害[7]。本研究中，证实在LPS诱导的BV2小胶质细胞神经炎症体外模型，propofol能够抑制TNF-α、IL-1β和IL-6表达，发挥抗炎作用。然而，propofol抗炎作用的具体机制尚不明确。

已有研究表明，TRPV1抑制剂能够减弱LPS诱导的小鼠抑郁样行为，其机制与炎症小体的抑制和IL-1β的释放减少有关[9-11]，这提示我们TRPV1在神经炎症中扮演重要的角色。在本研究中，我们观察到，LPS诱导小胶质细胞能够上调TRPV1表达，propofol干预处理能够下调TRPV1表达，提示TRPV1参与LPS诱导的小胶质细胞炎症反应。为进一步确定TRPV1是否参与到这个过程，我们使用AMG517(TRPV1通道小分子抑制剂)作干预，显示干预后细胞TNF-α、IL-1β和IL-6的表达受到抑制。既往研究证实，激活的TRPV1促进p-CaMKII的表达，增加Ca2+内流，导致胞内钙超载，从而兴奋感觉神经元，释放兴奋性氨基酸和多种神经肽，进而激活一系列细胞内信号传导通路，介导炎症因子的释放[21-23]。而我们也证实，propofol治疗能够抑制LPS诱导的小胶质细胞p-CaMKII的表达及降低胞内Ca2+浓度，提示propofol通过TRPV1抗小胶质细胞炎症反应的机制与p-CaMKII表达及胞内Ca2+浓度有关。