慢病毒载体CV072介导的Mfn2过表达抑制肝星状细胞活化*

朱含章， 葛 珂， 刘 凌， 沈伟敏， 贾长库

(浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院肝胆胰外科， 浙江 杭州 310006)

肝纤维化是一种严重影响人类健康的疾病，可以发展成肝硬化和肝细胞癌等严重疾病[1-2]，目前尚无显著有效的临床治疗方法。因此，开发对该疾病合适的治疗途径是至关重要的。肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)是肝纤维化的原发效应细胞，活化的肝星状细胞分化为成纤维细胞，产生大量的细胞外基质[3-5]。因此，抑制HSC活化可能是有前景的治疗肝纤维化的措施[6]。线粒体是一种与细胞功能状态高度相关的细胞器，在细胞增殖与凋亡过程中起着重要作用[7]。线粒体融合蛋白(mitofusin，Mfn)基因已在近年来克隆成功，Mfn基因在哺乳动物中有2种分子，即Mfn1和Mfn2，其中Mfn2是一种细胞增殖抑制基因，是促进线粒体融合所必须的成分，在促进细胞凋亡方面发挥调节功能[8]。Mfn2对HSC的活化作用以及在肝纤维化的患者或者动物实验中Mfn2是否发生了变化，目前尚未有研究证实。

在以往的研究中，我们成功构建并鉴定了载有大鼠线粒体融合蛋白2(rMfn2)基因的重组腺病毒Ad5-mCMV-rMfn2-EGFP过表达载体，但该表达为瞬时性，且当时未验证Mfn2基因的功能及其作用机制[9]。由于慢病毒相较于腺病毒具有稳定转染和表达的优势，因此，慢病毒介导Mfn2在HSC过表达是一种有效的方法。本研究旨在探讨转染慢病毒过表达载体CV072-pCMV- Mfn2-EGFP在细胞实验水平对HSC凋亡和纤维化相关蛋白的表达的影响，并进一步通过TGF-β1通路蛋白的变化评估慢病毒转染介导的Mfn2稳定过表达在细胞实验水平影响肝纤维化相关因子生成的机制。

材 料 和 方 法

1 材料

大鼠肝星状细胞株HSC-T6 购自中国科学研究院上海细胞库。DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自Gibco；Polybrene购自Sigma；TRIzol试剂和血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)购自Thermo Fisher；逆转录试剂盒、Taq 酶和SYBR® Premix Ex TaqTMII系统购自TaKaRa；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自BD；PVDF膜(Merck Millipore，0.2 μm)；单克隆兔抗大鼠Mfn2、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、Smad2和Smad3抗体购自Abcam；单克隆兔抗大鼠GAPDH抗体和羊抗兔的辣根过氧化物酶标记的IgG购自Cell Signalling Technology；Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原ELISA试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司；慢病毒过表达载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司；其余试剂为国产市售试剂。超滤管为Vivaspin® 20 Centrifugal Concentrator (Sartorius)。

2 方法

2.1 细胞培养 常规复苏HSC-T6细胞，加入含10%胎牛血清、1%卡那霉素和新霉素的DMEM 高糖培养基，并加入PDGF(终浓度为5 μg/L)，放置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。2～3 d换液，细胞长至80%左右，胰蛋白酶消化，传代培养。转染前1 d，选对数生长期状态良好的细胞，均匀接种于6 孔板中，接种密度为每孔5×104。

2.2 含Mfn2的慢病毒载体的构建 由上海吉凯基因化学技术有限公司完成，根据GenBank的大鼠Mfn2基因序列(NM_130894)将其作为目的基因，筛选和构建慢病毒Mfn2过表达载体，通过测序验证，证实构建成功。经酶切、电泳及Western blot 检测验证，证实Mfn2慢病毒过表达载体CV072-PCMV- Mfn2-EGFP(以下简称Lv-Mfn2)过表达成功后，进行慢病毒大规模包装并测定滴度。

2.3 慢病毒过表达载体Lv-Mfn2转染HSC-T6细胞 HSC-T6细胞接种于6孔板中，至70%～90%汇合度时转染，转染前更换无血清无卡那霉素和新霉素的新鲜培养基。于37 ℃、5% CO2培养箱中培养4～6 h后换液，更换为含有10%胎牛血清的培养基。每孔添加重组慢病毒和空载病毒(Vec)5×107TU，以未添加病毒的空白细胞作为对照(MOCK)。每孔中添加Polybrene浓度为8 mg/L，在37 ℃培养箱中转染12 h，PBS冲洗换液。进一步培养24～48 h，荧光显微镜下观察Mfn2过表达(Lv-Mfn2)、Vec组和MOCK组细胞中绿色荧光蛋白的表达情况及转染效率。

2.4 RT-qPCR检测Mfn2的mRNA表达 采用实时荧光定量PCR 法，按照TRIzol试剂说明提取细胞总RNA，用TaKaRa 逆转录酶进行逆转录合成cDNA。Mfn2的上、下游引物序列分别为5’-GATGACAGAGGAAGTGGAAAGGC-3’和5’-ACAGACACAGGAAGA-AGGGGCT-3’；GAPDH的上、下游引物序列分别为5’-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3’和5’-TTTGAG-GGTGCAGCGAACTT-3’。反应体系为20 μL，设立2 个复孔，热循环程序为：95 ℃ 3 min；然后95 ℃变性20 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸3 min，30个循环；最后72 ℃再延伸5 min。反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，以GAPDH 为内参照，计算目的基因Mfn2的mRNA相对水平，用2-ΔΔct表示。

2.5 Western blot检测Mfn2、α-SMA、 Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、TGF-β1、Smad2和Smad3的蛋白水平 将3组细胞分别加入适量细胞裂解液，使用细胞刮将细胞分别收集至1.5 mL离心管中，用RIPA 蛋白裂解液裂解，置于冰上裂解30 min，12 000 r/min离心10 min，取蛋白上清分装于1.5 mL离心管中，采用BCA 法测定蛋白浓度。取总蛋白150 μg，行10% SDS-PAGE ，经PVDF 膜转移，加 I 抗，4 ℃孵育过夜，TBST漂洗3次，每次5 min，孵育II抗(1 5 000)，室温振摇1 h；TBST漂洗3次，每次5 min，化学发光法曝光。采用Image Lab 软件对Wes-term blot 检测结果进行灰度分析，灰度值代表蛋白相对表达量。

2.6 ELISA检测I型、Ⅲ型和IV型胶原蛋白在HSC-T6细胞培养上清中的含量 HSC-T6细胞分组培养48 h后，收集上清液，用ELISA试剂盒测定上清液中Ⅰ型、Ⅲ型和IV型胶原的含量。

3 统计学方法

应用GraphPad Prism 5软件进行统计分析。每组实验重复3次，实验数据用均数±标准差(mean±SD)表示。利用单因素方差分析(one-way ANOVA)行多组间比较，各组间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 慢病毒转染HSC-T6细胞后绿色荧光蛋白的表达情况及转染效率评估

倒置荧光显微镜下观察慢病毒转染后Mfn2过表达组、空载病毒组和空白组细胞中绿色荧光蛋白表达情况及转染效率。使用细胞计数法评估，Mfn2过表达组和空载病毒组的细胞转染效率均大于90%，见图1。

Figure 1. The expression of green fluorescent protein and transfection efficiency in Mfn2 lentivirus over-expression (Lv-Mfn2)group, empty virus (Vec) group and blank (MOCK) group after lentivirus transfection were observed under inverted fluorescence microscope.

图1 Lv-Mfn2组、Vec组和MOCK组中HSC-T6细胞的形态和绿色荧光蛋白的表达情况

2 RT-qPCR和Western blot法检测慢病毒转染HSC-T6细胞后Mfn2的mRNA和蛋白表达

慢病毒转染后，Mfn2过表达组、空载病毒组和空白组培养48 h。使用RT-qPCR和Western blot法检测Mfn2的mRNA和蛋白表达，结果表明，Mfn2过表达组Mfn2的mRNA表达相对于空载病毒组和空白组均明显上升(P<0.01)，见图2A；同时，Mfn2过表达组Mfn2蛋白的表达水平与空白组和空载病毒组比较均明显上升(P<0.01)，见图2B。

Figure 2. The mRNA (A) and protein (B) expression of Mfn2 in each group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsMOCK group;##P<0.01vsVec group.

图2 各组HSC-T6细胞转染后Mfn2的mRNA和蛋白表达情况

3 Western blot法检测α-SMA的表达

Mfn2过表达组α-SMA的表达水平与空白组和空载病毒组比较均明显降低(P<0.01)，见图3。

Figure 3. The protein expression of α-SMA in each group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsMOCK group;##P<0.01vsVec group.

图3 各组细胞平滑肌肌动蛋白α-SMA的表达情况

4 Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3的水平

与空载病毒组和空白组比较，Mfn2过表达组的Bax和cleaved caspase-3蛋白水平均升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少(P<0.05)，见图4。

Figure 4. The protein levels of Bax, Bcl-2 and cleaved caspase-3 in each group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsMOCK group;##P<0.01vsVec group.

图4 各组细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3水平的变化

5 Western blot检测TGF-β1/Smad通路TGF-β1、Smad2和Smad3的蛋白水平

与空载病毒组和空白组比较，Mfn2过表达组中TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3的蛋白水平均降低(P<0.05)。而3组间Smad2和Smad3总蛋白水平的差异无统计学显著性，见图5。

6 ELISA法检测I型、Ⅲ型和IV型胶原蛋白在HSC-T6细胞培养上清中的含量

与空载病毒组和空白组比较，Mfn2过表达组I型、Ⅲ型和IV型胶原蛋白的水平均降低(P<0.05)，见图6。

讨 论

近年来的研究表明，肝纤维化的消减与活化状态的HSC减少有关，凋亡是导致活化HSC 减少的中心环节，而不是HSC表型的转化。HSC凋亡减少增加活化HSC的数量，不引起细胞器的破坏和微环境的炎症损伤[10-11]。因此，促进活化的HSC凋亡是防治肝纤维化的重要手段。Mfn2已被研究证明可促细胞凋亡，但在肝纤维化方面未有研究报道[12]，为了观察Mfn2是否和肝纤维化有关联，我们采用慢病毒转染HSC的方式使Mfn2过表达，观察其对HSC活化的作用，并测定平滑肌肌动蛋白α-SMA和各型胶原蛋白等肝纤维化相关因子，从而间接预测其对肝纤维化的影响。

Figure 5. The protein levels of TGF-β1, p-Smad2, p-Smad3, Smad2 and Smad3 in each group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsMOCK group；##P<0.01vsVec group.

图5 各组细胞TGF-β1/Smad通路蛋白TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、Smad2和Smad3水平的变化

Figure 6. The levels of type I, type III and type IV collagen (COL I, COL III and COL IV) in the cell culture supernatants in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMOCK group；#P<0.05vsVec group.

图6 各组细胞培养液上清中I型、Ⅲ型和IV型胶原蛋白水平的变化

以HIV-1为基础构建的慢病毒载体系统具有可感染分裂细胞和非分裂细胞，及免疫反应小等优点，还可以通过将其携带的基因片段整合到宿主细胞基因组，实现目的基因的稳定表达，而且感染效率高，免疫原性低[13-14]，因此我们选择CV072-pCMV-EGFP慢病毒载体携带Mfn2基因以达到高效转染HSC-T6细胞的目的，同时也可减少对周围组织的毒副作用。结果证实CV072-pCMV-Mfn2-EGFP转染HSC后高效表达Mfn2，同时纤维化的标志性蛋白α-SMA表达降低。进一步的，我们检查了Mfn2和HSC-T6细胞凋亡相关蛋白的关系，结果证实Mfn2增加HSC-T6凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平，抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少。为了深入探讨Mfn2和HSC-T6细胞的肝纤维化相关蛋白表达的关系及机制，我们选取了肝纤维化的重要通路TGF-β1/Smad通路进行研究。TGF-β可调节细胞生长和分化的多肽，在肝纤维化发生发展过程中具有活化HSC，促进胶原蛋白表达，促进基质合成与沉积等作用，是最重要的促肝纤维化细胞因子之一[15]。Smads蛋白是TGF-β受体复合物下游起重要作用的信号分子，TGF-β通过与Smad2和Smad3等结合，使其发生磷酸化，随后引起靶基因的转录，胶原等细胞外基质大量合成，进而促进肝纤维化[16]。我们的研究表明，Mfn2过表达可下调HSC-T6细胞的TGF-β1 及p-Smad2和p-Smad3的蛋白水平，而对Smad2 和Smad3非磷酸化蛋白无影响，导致TGF-β1/Smad通路的抑制，并引发α-SMA及I型、Ⅲ型和IV型胶原蛋白的表达下调，发挥拮抗肝纤维化相关因子生成的作用。

目前肝纤维化机制的研究表明，多种信号通路调控肝纤维化的发生发展，如NF-кB/IкBα、 p38 MAPK，抑制Ras、ERK1/2及JNK1/2介导的MAPK 信号通路传导则可以抑制HSC的过度增殖，促进其凋亡，而Mfn2 蛋白已被证实是Ras、ERK、JNK等MAPK 信号传导的负性调节因子，因此在HSC中，Mfn2基因抑制肝纤维化相关因子生成的机制亦可能与MAPK 信号通路的传导有关[17-18]。此外抑制PI3K/Akt和mTOR通路亦可促进HSC凋亡， 导致肝纤维化[18-19]，因此，我们推测Mfn2还可能通过多种其它信号通路抑制肝纤维化相关因子生成，从而调控肝纤维化的发生发展。Mfn2促进HSC凋亡和抑制肝纤维化相关因子生成的具体机制还值得进一步探索。在今后的实验中，我们还将在动物实验中进一步观察Mfn2引发的肝纤维化相关因子的变化及对肝纤维化进展的影响，从而为Mfn2是否参与肝星状细胞的凋亡调控及肝纤维化的调节提供更为充分的证据。