解郁丸对WKY大鼠的抑郁样行为及海马和前额叶皮层BDNF表达的影响*

宋 苗， 刘红梅， 李 琦， 张 宇， 徐 勇△

(山西医科大学 1基础医学院， 2第一医院精神卫生科， 山西 太原 030000)

抑郁症是一种慢性精神障碍性疾病，其核心症状包括情绪低落、快感缺失、应激性、注意力难以集中以及睡眠障碍等，重度抑郁患者会产生自杀观念和行为[1-2]。目前，临床上治疗抑郁症的药物主要通过增加神经元突触间隙单胺类递质浓度起作用，但由于长期服用会出现较严重的副作用并且存在有效率低的缺点，因此副作用少、相对温和的传统中药受到人们广泛的关注。解郁丸(Jieyuwan)由柴胡、当归、白芍、茯苓、百合、郁金、合欢、甘草、小麦和大枣等10种药物组成，临床治疗抑郁症效果良好；有研究表明解郁丸能增加不同脑区的5羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)和多巴胺(dopamine，DA)等神经递质含量[3]；也有研究发现其抗抑郁作用可能与降低海马和前额叶皮层单胺氧化酶活性有关[4]。关于解郁丸的抗抑郁机制尚未有定论，并且对于该药的抗抑郁作用与BDNF相关研究也较少见。

大脑中存在一些脑区(海马、前额叶皮层、下丘脑和杏仁核等)和环路调节着情绪、奖赏以及执行功能，这些相互关联的边缘系统的功能失调与抑郁和抗抑郁作用息息相关[5]。大量的尸检[6-7]及影像学[6, 8]研究表明，抑郁患者海马及前额叶皮层的灰质体积减少，胶质细胞密度降低，而这2个脑区被认为是调节抑郁认知的重要区域[9]。

脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是神经营养蛋白家族中的一种分泌型蛋白。BDNF于1982年被发现[10]，最初被描述为一种二聚体蛋白[11]，包括成熟BDNF(14 kD)和BDNF前体(32 kD)2种形态，与抑郁和焦虑密切相关[12]。对于抑郁症与BDNF之间的作用，许多研究者发现BDNF在抑郁症患者脑内表达水平是降低的[13]，经过抗抑郁治疗后BDNF的表达有所提高。

寻找新的抗抑郁药物的一个主要问题是缺乏类似抑郁症并且对抗抑郁治疗敏感的动物模型。很早之前有报道指出,Wistar-Kyoto(WKY)大鼠表现出内源性抑郁样行为[14-15]，如WKY大鼠容易出现习得性无助、在强迫游泳实验中漂浮不动水平非常高、旷场实验中活动性较低等。海马和杏仁核基因表达分析表明，WKY大鼠与慢性应激抑郁大鼠的分子机制具有差异性，这表明WKY大鼠不同的分子机制或许可以成为研究新型药物的目标[16]。Wistar大鼠与WKY大鼠属于同一品系，因此用作对照。

为此，本文主要研究解郁丸是否能够减少WKY大鼠的抑郁样行为、效果如何以及抑郁样行为的改变是否与海马及前额叶皮层中的BDNF相关。

材 料 和 方 法

1 实验动物及分组

成年雄性WKY大鼠和Wistar大鼠，SPF级，均购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK(京)2016-0006。所有大鼠每3只1笼，置于温度(22±2) ℃，湿度50%～60%的动物房中适应1周，期间自由饮食，12 h昼夜循环(白昼8:00～20:00)。Wistar大鼠10只作为空白对照(control)组，WKY大鼠随机分为3组，每组10只，分为WKY模型(WKY)组、西酞普兰(citalopram)组和解郁丸组。各组处理方式为：(1)对照组：生理盐水灌胃21 d；(2)WKY模型组：生理盐水灌胃21 d；(3)西酞普兰组：作为阳性对照，西酞普兰(10 mg/kg，丹麦灵北药厂)溶于生理盐水后灌胃21 d；(4)解郁丸组：解郁丸(212 mg/kg，河南泰丰制药股份有限公司)用0.5%的羧甲基纤维素钠制备混悬液，灌胃21 d。

2 方法

2.1 强迫游泳实验(forced swimming test，FST) 将大鼠放置于一直径20 cm、高40 cm的透明玻璃筒中，筒中水温在23～25 ℃，水深17～30 cm，保证大鼠双后肢不能接触圆筒底。观察5 min，记录分析大鼠漂浮不动时间(此时大鼠在水中漂浮，仅头部露出水面保持呼吸)。测试结束后将大鼠擦干，放回笼中。

2.2 糖水偏好实验(sucrose preference test，SPT) 实验前2 d为适应期，让大鼠适应双瓶含蔗糖饮水。第1天每只大鼠单独1笼，每笼放置等量2瓶纯水。第2天放置等量的2瓶1%蔗糖水。期间大鼠自由摄食。第3天开始糖水偏好测试，放置等重量2瓶，1瓶为纯水，1瓶为1%蔗糖水，测试时间为8:00～14:00，期间每3 h交换1次位置，测试结束前后称量2只水瓶，大鼠归于之前饲养环境。计算糖水偏好程度：糖水偏好系数(%)=糖水消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)×100%。

2.3 组织免疫荧光 大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(1%，50 mg/kg；Sigma)完全麻醉后，心脏灌流生理盐水，之后灌注4%多聚甲醛，小心取出脑组织浸泡入4%多聚甲醛后，在4 ℃后固定4～ 6 h，最后浸入30%蔗糖溶液沉底。取出沉底脑组织，滤纸吸干表面水渍，OCT包埋后固定在冰冻切片机中，切片厚度30 μm。贴片后晾干，0.3% Triton-PBS漂洗4次，每次5 min，丙酮-20 ℃固定20 min，同上漂洗4次，5%山羊血清37 ℃封闭60 min，加入 I 抗anti-BDNF antibody(1 500； Abcam)，4 ℃过夜；漂洗4次，加入荧光 II 抗Goat Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa Fluor®488，11 000；Abcam)，避光37 ℃孵育60 min，漂洗，加入DAPI(武汉博士得生物公司)，避光染色15 min，PBS漂洗3次,每次5 min，封片。

2.4 Western blot实验 大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)完全麻醉后，快速取下脑组织，冰上操作取出前额叶皮层和海马组织，液氮速冻，转移至-80 ℃保存。提取组织蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒(武汉博士得生物公司)测定蛋白浓度后将蛋白浓度调整一致，100 ℃煮蛋白7 min，冷却后电泳，电转至PVDF膜，0.3%明胶室温封闭2 h，I 抗anti-BDNF antibody(15 000；Abcam),4 ℃过夜。TBST洗膜3次,每次5 min， II抗anti-rabbit IgG, HRP-linked Antiboy(12 000； Cell Signaling Technology)室温1.5 h，TBST洗膜3次,每次5 min，ECL显影曝光。

3 统计学处理

用SPSS 22.0软件进行数据处理，数据以均数±标准误(mean±SEM)表示，组间差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间多重比较采用Bonferroni校正t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 强迫游泳实验的结果

与正常对照组大鼠相比，WKY大鼠在强迫游泳实验中的不动时间明显增加(P<0.01)，即WKY大鼠表现出明显的抑郁样行为；但给与解郁丸21 d治疗后的WKY大鼠此情况得到逆转，不动时间显著减少(P<0.01)，且与对照组比较差异无统计学显著性，见图1A。

2 糖水偏好程度的结果

糖水偏好的结果显示，WKY模型组大鼠对比正常对照组大鼠，糖水偏好程度明显降低(P<0.01)，表明WKY大鼠表现出快感缺乏行为；经过21 d干预治疗后，解郁丸组大鼠对比模型组大鼠糖水偏好程度明显提高(P<0.01)，且与正常对照组比较差异无统计学显著性，见图1B。

Figure 1. The results of behavioral experiments. A: the immobility time in forced swimming test; B: the results of sucrose preference test in different groups. Mean±SEM.n=10.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsWKY group.

图1 行为学实验结果

3 海马和前额叶皮层检测BDNF的免疫荧光结果

运用免疫荧光的方法从形态学上直观地观测WKY大鼠海马及前额叶皮层BDNF的表达情况。海马区免疫荧光染色发现，与空白对照组相比，模型组WKY大鼠的BDNF表达明显下降，同时发现海马区轴突数目的减少；在解郁丸治疗后，BDNF的表达水平有所提高且轴突数目增加，见图2。前额叶皮层荧光染色结果显示，模型组WKY大鼠的BDNF表达明显减少，解郁丸与西酞普兰组大鼠的BDNF表达明显高于模型组大鼠，见图3。

4 Western blot检测海马和前额叶皮层BDNF蛋白表达的情况

与control组相比，WKY大鼠海马的BDNF蛋白表达量明显降低(P<0.01)，前额叶皮层中的表达也降低(P<0.01)，解郁丸与西酞普兰治疗的WKY大鼠海马(P<0.01)与前额叶皮层(P<0.01)的BDNF水平增加，见图4。

讨 论

对于动物的抑郁样行为(例如快感缺乏和易产生绝望情绪等)的检测，我们运用行为学测试。在强迫游泳实验中，大鼠在水中漂浮不动的状态，反映其在面对无法逃脱的环境时产生的绝望情绪[17]。快感缺乏，是指无法从通常被认为是愉快的活动中体验到快乐，这种现象是人类严重抑郁症的核心症状之一[18-19]。有研究者提出，可用含糖水饮用的减少来反映实验动物的快感缺失[20]。本文结果显示WKY大鼠漂浮不动时间明显增多，并且对于糖水的喜爱程度也下降，说明了WKY大鼠表现出抑郁的核心特征；而解郁丸具有逆转此结果的作用，有效减少了WKY大鼠的抑郁样行为，并且与阳性对照的西酞普兰组无明显差异。

Figure 2. The expression of BDNF in hippocampal CA1 region detected by immunofluorescence method. The scale bar=50 μm.

图2 BDNF在海马CA1区中的表达

Figure 3. The expression of BDNF in prefrontal cortex detected by immunofluorescence method. The scale bar=20 μm.

图3 BDNF在前额叶皮层中的表达

Figure 4. The protein expression of BDNF in rat hippocampus and prefrontal cortex detected by Western blot. Mean±SEM.n=8.

**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsWKY group.

图4 Western blot 检测BDNF蛋白的表达水平

关于抑郁的“神经因子假说”是指BDNF有促进突触生长、维持神经元生存的作用，各种原因导致脑内BDNF缺少、其介导的信号转导作用的紊乱则会导致抑郁；而抗抑郁治疗则是通过增加脑中BDNF的含量、提高突触的可塑性并促进神经元的存活和增殖来发挥作用[21]。实验结果显示，WKY大鼠BDNF表达是下降的，但在药物治疗后BDNF表达水平显著上调，这也就说明解郁丸在抗抑郁治疗中会提高海马和前额叶皮层BDNF的表达水平，符合了该假说。BDNF与特异性受体酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor B，TrkB)有高度亲和力，研究发现BDNF表达的上调可增加突触后的TrkB水平，激活BDNF的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)等信号转导通路的级联反应[5, 22]，MAPK/ERK信号通路的激活可以增加相关抗凋亡蛋白的合成，从而阻滞神经元凋亡。这一系列的反应对促进突触的生长、维持神经元生存和增殖有重要意义[23]。在本研究中，我们观察到BDNF在抗抑郁治疗中的改变或许与这种级联反应有关。

值得注意的是，本研究观察到免疫荧光中海马区可见WKY大鼠神经元轴突的减少，而抗抑郁治疗后轴突增多，这或许与BDNF在神经可塑性中起着关键作用有关，因有研究表示BDNF影响着突触重塑、神经元发生、轴突增长以及神经元的存活和增殖等过程[24]。BDNF诱导的突触可塑性和行为改变的关键通路依赖于ERK/CREB信号通路[24]，ERK 是MAPK家族的成员，它被认为是一种生物化学信号整合器和检测器，用于协调次级通路对细胞外信号的反应，从而调节神经元的可塑性[1]。

本研究运用西酞普兰作为解郁丸的阳性对照，在各组实验结果中二者对WKY大鼠的抗抑郁疗效没有明显的差异，并且都对海马和皮层BDNF的表达有影响。但解郁丸作为中药，成分相对复杂，其抗抑郁作用可能不是单一机制作用的结果，所以若要真正明确解郁丸的作用机制或许还需要在多方面同步进行整体性的探究。

doi:10.1038/s41380-019-0415-3.[Epub ahead of print]