白刺果提取物花色苷通过抑制肝脏纤维化及炎症减轻非酒精性脂肪性肝病*

杨江霞， 白建英, 李付平△， 张秀芬， 徐昭娟， 赵 冬

(河北中医学院 1实验中心， 2护理学院， 3教务处， 河北 石家庄 050200)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)大部分由单纯性非酒精性脂肪肝发展而来，主要病理表现为肝脏的脂肪沉积及肝脏纤维化，大部分在不摄取过量酒精的情况下发展[1]。NAFLD引起的肝脏脂肪变性和肝脏纤维化，最终导致肝硬化和肝癌[2]。高血压、高血脂及肥胖是NAFLD的高危因素[3]。双击理论是目前公认的NAFLD的病理进展学说之一，第1个打击是指肝细胞的脂肪酸沉积，从而导致了炎症细胞浸润、炎症因子升高及氧化应激的第2次打击，最终导致肝脏损伤、感染及纤维化，其中，炎症细胞肝脏浸润及炎症因子包括肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-6等的释放对肝脏的损伤被认为是NAFLD的重要病理生理过程[4]。目前临床上无特异性针对治疗NAFLD的药物。

白刺属(Nitraria)是蒺藜科一个古老的属，为多分枝的耐盐喜潜水旱生低矮灌木，主要分布在荒漠。有研究证明白刺果的有效成分花色苷(anthocyanins，Anth)可缓解脂肪肝症状[5]。有研究表明，提高胰岛素敏感性，降低体重可缓解NAFLD，而花色苷也可以刺激胰岛素分泌，降低体重。利用高脂饮食(high-fat diet，HFD)可构建NAFLD小鼠模型，已知NAFLD会伴有炎症因子上调[6]。本研究利用花色苷对NAFLD小鼠模型进行干预，研究其是否能缓解由NAFLD引起的肝功能异常及作用机制。

材 料 和 方 法

1 实验材料

1.1 实验动物 成年C57BL/6小鼠购自河北医科大学生物医学工程中心，许可证号为SCXK(冀)2014-1-009，相对湿度45%～55%，每天光照12 h，SPF动物房饲养1周后进行实验。

1.2 实验试剂 油红O染色试剂盒(上海鲁汶生物科技有限公司)；丙氨酸氨基转移酶(alanine ami-notransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三脂(triglyceride，TG)和低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；Masson’s trichrome染色试剂盒(Biosis)；抗TNF-α抗体(Santa Cruz)；抗IL-1β抗体(Abcam)；抗IL-6和IL-10抗体(Cell Signaling Technology)；抗CCL7和单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)抗体(Bioworld)。

2 方法

2.1 小鼠HFD模型的构建及分组 24只小鼠分为3组，每组8只，分别为：对照(control)组，正常饮食；HFD组，给予高脂饮食30周；HFD+Anth组，给予高脂饮食30周后，每天腹腔注射花色苷(2 mg/kg)，持续4周，对照组及HFD组则给予等量生理盐水腹腔注射。待实验结束后，小鼠称重后，断头取血，分离血清，解剖小鼠肝脏并称重。

2.2 血清ALT、AST、TC、TG和LDL-C的检测 小鼠血清中ALT、AST、TC、TG和LDL-C的检测按照相应试剂盒说明书的方法，在96孔板上，制备相应的标准曲线，并在样品孔加入样品。待样品与试剂共孵育2 h后，采用酶标仪检测570 nm波长处吸光度(A值)。各血清样品中ALT、AST、TC、TG和LDL-C的含量采用对应的标准曲线计算。

2.3 HE染色 小鼠肝脏组织经4%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)固定、30%蔗糖脱水、石蜡包埋后5 μm切片，苏木精染色洗涤后用伊红染色后封片，显微镜观察。

2.4 油红染色 小鼠肝脏组织经4% PFA固定后，释放油红储存液，过滤后室温放置10 min，染色10 min后脱色，苏木素复染，PBS漂洗，甘油明胶封片显微镜观察。

2.5 Masson染色 小鼠肝脏组织石蜡切片常规脱蜡、水化，Masson’s 试剂盒中试剂A染核15 min，充分水洗，显蓝后镜检，烘箱干燥，再使用试剂B染色10 min，再加入试剂C，清洗玻片，去除染液B，每次3 min，滴加试剂D处理3 min。95%乙醇、无水乙醇、二甲苯透明、中性树胶封闭显微镜拍照。

2.6 免疫组织化学检测 小鼠肝脏组织经4% PFA固定、30%蔗糖脱水、石蜡包埋后5 μm切片，先用枸椽酸钠高温修复后，过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，之后以1200稀释比例孵育Ⅰ抗体(F4/80、CD45、CD11b、CCL7及MCP-1)，4 ℃过夜。次日，PBS洗涤后用HRP标记的 II 抗孵育1 h，之后用DAB显色液显影后显微镜拍照。

2.7 Western blot法检测蛋白表达水平 取小鼠肝脏组织利用RIPA裂解液萃取细胞全蛋白。利用BCA法将各组蛋白样品定量至相同浓度后，取30 μg蛋白进行SDS-PAGE。电泳结束后，湿转法将蛋白质转移至甲醇预活化的PVDF膜，转膜条件为恒压100 V，2 h。之后利用5%脱脂牛奶室温下封闭1 h并以12 000的稀释比例孵育Ⅰ抗体(TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-10)， 4 ℃过夜;次日，以TBST洗涤后室温孵育相应的HRP(110 000)标记的 II 抗1 h，以TBST洗涤后利用化学发光成像仪显影。

3 统计学处理

用SPSS 19.0软件行统计学分析。实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，若数据经检验符合正态分布或方差齐，多组间比较采用单因素方差分析，各组均数的两两比较用Bonferroni-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 白刺果提取物花色苷降低高脂饮食引起的非酒精性脂肪肝小鼠的肝重/体重比值，减轻肝脏功能异常

通过给予小鼠高脂饮食后，小鼠肝脏重量、ALT、AST、总胆固醇、甘油三酯及LDL-C均较对照组升高(P<0.01)；给予花色苷干预后，肝脏重量、ALT、AST、总胆固醇、甘油三酯及LDL-C均较HFD组降低(P<0.01)，见图1。

Figure 1. Anthocyains attenuated liver weight, serum ALT level, serum AST level, serum TC level, serum TG level and serum LDL-C level in the NAFLD mice induced by high-fat diet (HFD). Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHFD group.

图1 花色苷能降低非酒精性脂肪肝的肝重，减轻肝脏功能异常

2 白刺果提取物花色苷减轻由高脂饮食引起的非酒精性脂肪肝的纤维化

HE染色、油红染色及Masson染色结果显示，HFD组有明显的肝脏纤维化、脂滴沉积及胶原纤维增生，而花色苷干预能明显减轻这些由高脂饮食引起的纤维化表现，见图2。

3 白刺果提取物花色苷降低由高脂饮食引起的非酒精性脂肪肝组织的炎症因子水平

Wester blot检测结果显示，HFD组小鼠肝脏的炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-10均较control组升高(P<0.01);HFD+Anth组小鼠肝脏的炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-10均较HFD组降低(P<0.01)，见图3。

4 白刺果提取物花色苷能减轻非酒精性脂肪肝组织的巨噬细胞、白细胞及单核细胞浸润

通过免疫组织化学染色检测巨噬细胞、白细胞及单核细胞的细胞表面标志F4/80、CD45及CD11b，显示高脂饮食能明显导致肝脏巨噬细胞、白细胞及单核细胞在肝脏中央静脉周围的浸润，且与control组相比显著增多(P<0.01)；而花色苷干预能降低巨噬细胞、白细胞及单核细胞在肝脏浸润的数目，且较HFD组相比差异有统计学意义(P<0.01)，见图4。

Figure 2. Anthocyains attenuated hepatic fibrosis in NAFLD mice induced by high-fat diet (HFD).

图2 花色苷缓解非酒精性脂肪肝的纤维化

Figure 3. Anthocyains attenuated hepatic inflammatory factor levels in the liver tissues of NAFLD mice induced by high-fat diet (HFD). Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHFD group.

图3 花色苷能降低非酒精性脂肪肝的炎性因子水平

Figure 4. Anthocyains reduced infiltration of macrophages, leukocytes and monocytes in the liver tissues. Mean±SEM.n=8.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHFD group.

图4 花色苷能缓解非酒精性脂肪肝组织巨噬细胞、白细胞及单核细胞的浸润

5 白刺果提取物花色苷可缓解由高脂饮食导致的小鼠肝脏CCL7与MCP-1的升高

免疫组化结果显示,HFD组小鼠CCL7与MCP-1的表达水平较control组升高(P<0.01)；HFD+Anth组CCL7与MCP-1的表达水平较HFD组降低(P<0.01)，见图5B。

Figure 5. Anthocyains inhibited the expression of chemokines CCL7 and MCP-1. Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHFD group.

图5 花色苷能降低非酒精性脂肪肝小鼠肝脏组织趋化因子CCL7及MCP-1的表达

讨 论

因NAFLD后期进展可致肝硬化及肝癌[7-8]，所以在前期有效的预防肝硬化具有十分重要的意义。有研究表明脂质沉积[9]、氧化应激[10]、炎症因子释放[11]和炎症细胞浸润[12]均可导致肝硬化和肝损伤，也是NAFLD的重要病理发展过程。本研究利用高脂饮食建立小鼠NAFLD模型，结果显示高脂饮食可降低肝功能、增加体重及促进肝脏纤维化，而白刺果提取药花色苷则缓解了这一症状。

炎症细胞肝脏浸润及炎症因子释放对肝脏的损伤被认为是NAFLD的重要病理生理过程。而炎症细胞可释放多种炎症因子及细胞因子，包括TNF-α、IL-1β和IL-6等。TNF-α和IL-1β主要来源于急性或慢性肝损伤时的单核细胞及巨噬细胞[13]。研究表明，通过抑制炎症细胞浸润及其释放炎症因子可缓解NAFLD的病理进程[14-15]。本研究发现，高脂饮食可导致炎细胞包括巨噬细胞、白细胞及单核细胞在肝脏的广泛浸润，从而释放多种炎症因子，包括TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10，从而导致肝损伤，而花色苷可明显缓解炎细胞浸润，减少炎症因子在肝内的聚集，从而改善NAFLD的病理改变，与以往研究一致。

CCL7及MCP-1是肝脏中单核细胞重要的趋化因子[16]。在急性或慢性肝损伤中，MCP-1可趋化单核细胞，从而导致肝纤维化。CCL7，也被称为单核细胞趋化蛋白3，属于MCP家庭成员。单核细胞、成纤维细胞及内皮细胞可释放CCL7，从而导致炎症[17]。CCL7与MCP-1的释放增多可趋化各种炎细胞增殖并释放炎症因子[18-19]。而本研究也发现在高脂饮食中，CCL7及MCP-1在肝内的表达明显增高，而花色苷可明显减少CCL7及MCP-1的表达，从而使炎细胞趋化作用减弱，炎性因子释放减少，从根本上改善NAFLD。

综上所述，我们证实了花色苷能缓解由高脂饮食引起的肝功能损伤和肝纤维化，其机制主要是由于花色苷能降低炎症趋化因子CCL7及MCP-1，从而减少炎症细胞在肝脏内的浸润，进而减少炎症因子的释放，从而减慢了肝脏纤维化的进程。因此，花色苷可作为NAFLD潜在的预防及治疗药物，但是，临床上的效果尚待进一步的验证。