丙泊酚对乳腺癌MCF-7细胞CXCR4/CXCR7表达和体外迁移的影响*

杨陶波， 易 寒， 宋 娟， 陈 菲， 朱 莹， 王寿勇

(重庆医科大学附属儿童医院麻醉科，儿童发育疾病教育部重点实验室，儿科学重庆市重点实验室，儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地，重庆 400014)

丙泊酚(propofol,P)是目前临床上最常使用的全身麻醉药物之一。研究表明，丙泊酚能够抑制包括乳腺癌在内的多种肿瘤的复发和转移[1-3]，但其机制目前尚不完全清楚。与此同时，趋化因子及其受体与肿瘤复发和转移的密切关系已经得到证实，CXC趋化因子受体(CXC-chemokine receptor，CXCR)4/CXCR7介导的信号转导被认为在肿瘤转移和复发中起着重要作用[4-6]。丙泊酚是否能够通过CXCR4/CXCR7信号途径而影响肿瘤细胞的转移，值得关注。本研究拟以人乳腺癌MCF-7细胞为研究对象，观察临床浓度的丙泊酚对其CXCR4/CXCR7表达和体外迁移能力的影响。

材 料 和 方 法

1 细胞和主要试剂

MCF-7细胞株由本院中心实验室保存。丙泊酚(AstraZeneca)；脂肪乳(lipid emulsion,E；购自四川科伦)；胎牛血清(杭州四季青)；DMEM培养基(Gibco)；兔抗人CXCR7多克隆抗体(GeneTex)；兔抗人CXCR4多克隆抗体(北京博奥森)；鼠源GAPDH的 I 抗及辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔IgG抗体(北京中杉金桥)；重组人基质细胞衍生因子1α(stromal cell derived factor 1α,SDF-1α;购自Peprotech)；Transwell小室(Corning)；TRIzol和逆转录试剂盒(TaKaRa)；实时荧光定量试剂盒(北京天根)；结晶紫染液购于碧云天生物研究所；MTT试剂盒购自北京索莱宝公司；PCR引物由上海生工合成。

2 主要方法

2.1 细胞培养及分组 在37 ℃、5% CO2条件下，用含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的DMEM培养细胞，2 d换液 1 次。将处于对数生长期的细胞接种在6 cm培养皿中，随机分成4组：对照组(control,C组)、脂肪乳组(E组)、丙泊酚3 mg/L组(P1组)和丙泊酚8 mg/L组(P2组)。

2.2 细胞处理 待细胞长到80%融合时，更换无血清培养基饥饿细胞12 h，然后P1组和P2组分别更换含有终浓度为3 mg/L和8 mg/L丙泊酚的培养基，E组更换含有脂肪乳的培养基，C组更换新鲜普通培养基。

2.3 划痕实验检测细胞的横向迁移能力 将细胞接种于6孔板，待细胞长到80%左右时，换无血清培养基，饥饿细胞12 h，用200 μL枪头在每孔相同的位置做线性划痕，用PBS轻轻冲洗3次，每孔加入含有浓度为100 μg/L SDF-1α的DMEM完全培养基2 mL，在倒置显微镜下拍照，并沿划痕边缘等间距取3处测量划痕宽度，取平均值，记为0 h划痕宽度。继续培养24 h后取出6孔板，在相同观察点测量划痕宽度，计算划痕愈合率：划痕愈合率(%)=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

2.4 Tanswell小室检测细胞的纵向迁移能力 各组细胞采用预热至37℃的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤2次，重悬于无血清培养基中，采用Countstar细胞计数仪调整其浓度为5×108/L。Transwell上室每孔加入细胞悬液200 μL，下室加入含100 μg/L SDF-1α的完全培养基800 μL，以不含SDF-1α的完全培养基为空白对照。在37 ℃、5% CO2平衡的恒温箱内培养细胞24 h后取出，无水甲醇固定20 min，结晶紫染色30 min，棉签抹去上层未迁移的细胞，随机取6个视野(×400)在倒置显微镜下拍照，计算MCF-7细胞趋化指数(chemotactic index,CI)：CI=各观察孔趋化至下室的细胞总数/空白对照孔趋化至下室的细胞总数。

2.5 RT-qPCR测定CXCR4和CXCR7的mRNA水平 根据NCBI Genebank中的CXCR4、CXCR7和β-actin序列设计引物，见表1。细胞加药处理24 h后采用TRIzol法提取细胞中的总RNA，经纯化后逆转录获取cDNA，然后采用实时荧光定量PCR测定CXCR4和CXCR7的mRNA水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，并同时测定β-actin水平为内参照，目的基因表达水平使用2-ΔΔCt法分析。反转录条件设定为37℃ 15 min、85 ℃ 5 s。实时荧光定量PCR反应条件为：95 ℃ 15 min;95 ℃ 10 s、60 ℃ 32 s，共40个循环。

表1 RT-qPCR引物序列

2.6 Western blot 检测CXCR4和CXCR7蛋白表达水平 细胞加药处理24 h后参照蛋白提取细胞试剂盒说明书提取总蛋白，BCA法测定全蛋白浓度，加缓冲液煮沸5 min变性。以30 μg蛋白上样行SDS-PAGE，将分离胶上的蛋白湿转到PVDF膜上，用10%脱脂奶粉封闭1 h，加入特异性抗CXCR4和CXCR7抗体，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次；加入辣根过氧化物酶标记的 II抗，室温孵育1 h，TBST洗涤3次，每次10 min。以GAPDH为内参照，ECL曝光显影，结果采用Bio-Rad quantity One软件进行分析。

2.7 MTT法测定细胞活力 细胞培养至对数生长期后，每孔4 000个细胞接种于96孔培养板中，每组设置3个复孔，同时设置脂肪乳和空白对照。P1和P2组细胞培给予相应浓度丙泊酚处理，对照组分别给予等体积脂肪乳或培养液，继续培养细胞24 h,小心吸去上清，加入90 μL新鲜培养液和10 μL MTT溶液，继续培养4 h。去除细胞培养液，每孔加入二甲基亚砜溶液110 μL，待结晶物溶解后，用酶标仪检测490 nm处吸光度(A)值,计算细胞的存活率：细胞存活率(%)=(实验组A值-空白对照组A值)/(对照组A值-空白对照组A值)×100%。

3 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，Graph Pad Prism 7.0绘图。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用Bonferroni法，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 丙泊酚对MCF-7细胞横向迁移能力的影响

划痕实验结果显示，C组、E组、P1组和P2组4组细胞24 h划痕愈合率分别为39.42%±2.21%、37.72%±1.64%、20.01%±1.48%和18.36%±1.80%, E组划痕愈合率与C组的差异无统计学显著性，P1和P2组愈合率较C组下降(P<0.05)；与E组相比， P1和P2组愈合率下降(P<0.05)；P1组与P2组比较，差异无统计学显著性，见图1。

Figure 1. The effects of propofol on the migration ability of MCF-7 cells detected by wound-healing assay (×100). Mean±SD.n=3.#P<0.05vsC group;*P<0.05vsE group.

图1 丙泊酚对MCF-7细胞划痕愈合率的影响

2 丙泊酚对MCF-7细胞纵向迁移力的影响

SDF-1α趋化实验结果显示，C组、E组、P1组和P2组4组趋化指数分别为1.68±0.13、1.49±0.08、1.09±0.06和1.00±0.05。E组趋化指数较C组差异无统计学意义，P1和P2组趋化指数较C组降低(P<0.05)；与E组相比，P1与P2组趋化指数下降(P<0.05)；P1与P2组比较，差异无统计学显著性，见图2。

3 丙泊酚对MCF-7细胞CXCR4/CXCR7 mRNA表达的影响

RT-qPCR结果显示，各组CXCR4/CXCR7的mRNA表达水平的差异无统计学显著性，见图3。

4 丙泊酚对MCF-7细胞CXCR4/CXCR7 蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示，E组CXCR4/CXCR7 的蛋白表达水平较C组差异无统计学显著性，P1和P2组表达水平较C组降低(P<0.05)；与E组相比，P1、P2组CXCR4/CXCR7的蛋白表达降低(P<0.05)；P2组CXCR4/CXCR7 蛋白表达水平较P1组差异无统计学显著性，见图4。

Figure 2. The effects of propofol on the migration ability of MCF-7 cells detected by Transwell assay (×400).Mean±SD.n=3.#P<0.05vsC group;*P<0.05vsE group.

图2 丙泊酚对MCF-7细胞趋化能力的影响

Figure 3. The effects of propofol on the mRNA expression of CXCR4/CXCR7 in the MCF-7 cells. Mean±SD.n=3.

图3 丙泊酚对MCF-7细胞CXCR4/CXCR7 mRNA表达的影响

Figure 4. The effects of propofol on the protein expression of CXCR4/CXCR7 in the MCF-7 cells. Mean±SD.n=3.#P<0.05vsC group;*P<0.05vsE group.

图4 丙泊酚对MCF-7细胞CXCR4/CXCR7蛋白表达水平的影响

5 丙泊酚对MCF-7细胞活力的影响

MTT实验结果显示，与C组相比，P1和P2组MCF-7细胞活力无显著改变，见图5 。

Figure 5. The effects of propofol on the viability of MCF-7 cells. Mean±SD.n=3.

图5 丙泊酚对MCF-7细胞活力的影响

讨 论

本研究发现，丙泊酚对人乳腺癌MCF-7细胞株CXCR4/CXCR7 mRNA表达水平和细胞活力无显著影响，但可显著降低其CXCR4/CXCR7蛋白的表达水平，抑制体外培养的MCF-7细胞迁移能力。

肿瘤细胞的迁移能力反映其侵袭能力，临床上表现为手术后肿瘤的转移和复发，后者是目前恶性肿瘤外科治疗上面临的最严峻的挑战。有研究表明，接受丙泊酚麻醉的患者，其术后肿瘤的转移、复发风险有所降低，无复发生存时间延长[1-3]，但相关研究结论仍然存在争议[7-8]，这表明对丙泊酚影响肿瘤迁移能力的现象，还需从多种可能的机制进行广泛探讨。CXCR4和CXCR7同为C-X-C趋化因子受体亚家族，属于典型的具有7次跨膜区段的G蛋白偶联受体，与SDF-1构成经典的生物信号轴，在胚胎发育、病毒感染、干细胞归巢以及肿瘤细胞转移等广泛生物学过程中起着重要作用[9-11]。有研究表明，SDF-1/CXCR4信号通路激活，可以促进肿瘤细胞基质金属蛋白酶及调控血管细胞间黏附分子-1和整合素β1等表达，从而促进肿瘤细胞的侵袭和转移[12-14]。本研究发现，经丙泊酚处理后，MCF-7乳腺癌细胞株的CXCR4和CXCR7蛋白表达水平受到抑制，细胞对SDF-1的趋化能力明显下降；这表明丙泊酚可能通过影响SDF-1/CXCR4(CXCR7)信号通路抑制MCF-7细胞的迁移能力，提示对于临床上采用手术治疗的乳腺癌患者，有可能通过采用丙泊酚全身麻醉而优化治疗效应，降低手术后恶性肿瘤的转移和复发风险；也提示CXCR4和CXCR7受体拮抗剂可能在抑制恶性肿瘤转移方面具有临床价值。与此同时，本研究还发现3和8 mg/L丙泊酚对体外培养的MCF-7细胞活性没有明显影响，提示其对细胞迁移能力的抑制，并非通过降低细胞活性所致[15]。

此外，本研究发现丙泊酚在抑制CXCR4和CXCR7蛋白表达水平的同时，其mRNA表达并未发生明显改变，其机制值得思考。有研究显示，丙泊酚可以在不改变基因表达水平的情况下，通过抑制泛素复合酶体的降解而提高小鼠心肌小窝蛋白3的表达水平，从而产生心肌保护效应[16]；也可通过激活泛素复合酶体的活性而加速PTEN蛋白的降解，活化AKT信号途径而缓解缺血性脑损伤[17]。在本研究中，丙泊酚在未改变CXCR4/CXCR7 mRNA水平的情况下，引起了其蛋白表达水平的变化，从而导致体外培养的MCF-7细胞迁移能力下降，是否是由于丙泊酚通过前述类似机制引起CXCR4/CXCR7蛋白降解加快，或在基因转录后水平发挥了调节作用所致，值得进一步研究。

作为目前临床上最常用的全身麻醉药，丙泊酚的临床麻醉浓度为3～8 mg/L[18]，本研究以人源MCF-7乳腺癌细胞为实验对象，证实上述临床麻醉浓度的丙泊酚能明显抑制MCF-7细胞迁移能力。同时，前述2种浓度的丙泊酚对MCF-7细胞体外迁移能力的抑制程度相似，提示在临床浓度范围内，丙泊酚对MCF-7细胞的影响程度没有显著差异。但更高或更低浓度的丙泊酚，以及其不同作用时间的抑制效应如何，值得进一步研究。

此外，包括乳腺癌在内的恶性肿瘤的转移和术后复发涉及复杂的信号网络途径，本研究结果仅提示CXCR4/CXCR7信号途径参与其中，其重要性到底如何，以及它与其它信号途径之间如何协同和相互影响，尚需要进一步探索。并且恶性肿瘤细胞的体内复发和转移所面临的生物学环境与离体培养实验存在巨大差异，本研究结果能否在活体动物实验或临床上获得证实，尚有待进一步研究。

综上所述，临床麻醉浓度的丙泊酚对体外培养的MCF-7人乳腺癌细胞的迁移能力具有抑制作用，其机制与抑制CXCR4/CXCR7信号转导途径有关，与抑制细胞活性无关。