高效液相色谱法测定血液透析器中二苯基甲烷二异氰酸酯的溶出量

徐苏华（通信作者），柯军，颜林，叶晓燕，梁泽鑫

广东省医疗器械质量监督检验所 （广东广州 510006）

血液透析通过弥散、对流、超滤、吸附等机制清除体内有害物质，维持水电解质平衡[1]。血液透析器简称透析器，是血液和透析液进行溶质交换的管道和容器，是血液透析的关键部分。透析器主要由支撑结构和透析膜组成，后者是其重要组成部分，为半透膜，只允许小于膜孔径的分子通过，膜材料为改良的纤维素膜和合成膜两种，两者均可制成高通量的透析器。聚氨酯密封胶在医学领域中的应用主要是血浆分离器等中空纤维型血液透析装置的密封,人工肝、肾器官的灌注密封等。血液透析器的主要部件中空纤维束是由密封胶浇注粘结固定在透析器的外壳之中的[2]。

二苯基甲烷二异氰酸酯（diphenylmethane diisocyanate，MDI）在工业上广泛用于制造硬质泡沫、热塑性聚氨酯弹性体、涂料、粘合剂、弹性纤维、建筑材料等[3-5]。血液透析器中的聚氨酯密封胶便是由MDI合成而来，MDI因两个异氰酸酯基团在苯环上的位置不同，有4,4'-MDI、2,4'-MDI和2,2'-MDI等异构体。制备聚氨酯所用MDI以4,4'-MDI为主。4,4'-MDI以气体形态存在时，具有一定的毒性，会刺激皮肤、眼睛和呼吸道，引起人类哮喘、过敏性肺炎和上呼吸道炎症等疾病[6]。有研究表明，MDI染毒干扰了睾丸组织的有氧代谢，抑制了细胞对能量的利用,可损伤各级生精细胞，造成生精上皮的损伤,并且通过脂质过氧化反应对睾丸组织造成一定程度的损伤，继而引起精子生成减少和睾丸重量下降,造成雄性生殖系统的损伤，并且这种损伤呈现出一定的剂量-反应关系[7]。同时，有研究表明，亚慢性毒性、慢性毒性、致癌性试验中，MDI均有毒性反应，其气体对小鼠的最小安全剂量（no observed adverse effect level，NOAEL）为0.19 mg/m3[8-9]。

4,4'-MDI分子式为（C6H4NCO）2CH2，带有两个异氰酸酯基（-N=C=O）。MDI固体形态时，通过对小鼠重复给药发现，4,4'-MDI在与血液接触后会迅速分解，其主要降解产物为4,4'-二氨基二苯甲烷（MDA），分子式为C13H14N2。国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）将MDI分级为3，即对人体不具备致癌性，而MDA的分级为2B，即可能对人体致癌[6]。国内外对MDI的研究主要为环境中MDI对人体的影响[10-12]，医疗器械中MDI的测量较少报道[13-14]。本研究采用高效液相色谱仪，用甲醇作为浸提介质，模拟临床使用制备浸提液，建立了检验MDI的高效液相色谱法，并进行了方法学验证。

1 材料与方法

1.1 试剂和样品

试剂：甲醇（分析纯，含量≥99.5%，广州化学试剂厂）；乙腈（HPLC色谱纯，默克股份两合公司）；4,4'-二氨基二苯甲烷（标准品，99.5%，北京百灵威科技有限公司）；乙酸铵（分析纯，含量≥98.0%，广州化学试剂厂）；去离子水（18.25 MΩ.cm）。样品：血液透析器（A公司生产，型号：B-20HF）

1.2 试验仪器及条件

仪器：高效液相色谱仪（日本岛津LC-20AT）。条件：色谱柱为 Inertsil®ODS-SP， 4.6 mm×250 mm，5 μm ；流动相为0.05 mol/L乙酸铵/乙腈（70/30）；流速为1.0 ml/min，检测波长为250 nm，进样量为20 μl。

1.3 溶液配制

1.3.1 对照品溶液制备

称取50 mg 4,4'-二氨基二苯甲烷（MDA）对照品于100 ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释制成500 μg/ml的MDA母液。取母液用乙腈逐级稀释分别配制0.5 μg/ml、0.7 μg/ml、1.25 μg/ml、2.5 μg/ml、5 μg/ml的系列对照品溶液。对照品溶液经0.45 μm滤膜过滤，在上述色谱条件下进行测定，每个浓度重复测定3次取平均值，得到MDA标准曲线。

1.3.2 浸提液和供试液的制备

取一套样品与玻璃烧瓶连成一个循环系统，加入500 ml甲醇并保持在（37±1 ）℃，通过蠕动泵作用于一段尽可能短的硅橡胶管上，使甲醇分别以200 ml/min和400 ml/min的流量循环5.5 h，得到浸提液1和浸提液2。不接透析器同法制备空白溶液。分别取空白溶液、浸提液1和浸提液2各50 ml在40 ℃下旋转蒸干，将残留物溶解在2 ml 乙腈中，经0.45 μm滤膜过滤，得到空白供试液、供试液1和供试液2。

2 结果

2.1 专属性

空白溶液和浓度为0.5 μg/ml的MDA对照样品溶液，在上述色谱条件下进行测定，结果见图1。结果显示MDA的保留时间约为17.000 min，理论塔板数为10 532，分离度为29，拖尾因子0.984，空白溶液无待测物质峰，待测物质与其他峰无干扰，表明该色谱条件可用来测定MDA的含量。

图1 液相色谱图

在1.2的色谱条件下进样分析，以各组分浓度峰面积和对照品浓度作图，得到MDA标准品曲线，见图2。回归方程为Y=86678.4X＋168.116，相关系数r=0.99996123，表明MDA浓度在0.5～5.0 μg/ml范围内线性关系良好。

2.2 检测限与定量限

取MDA对照品溶液，按需求等比稀释，将得到的低浓度对照品溶液进行检测。检测限：平均信噪比（S/N）约3.5时，最低检测浓度为0.02 μg/ml；定量限：平均信噪比（S/N）约为10时，检测浓度为0.05 μg/ml。

2.3 精密度

图2 MDA对照品线性图

重复性：取浓度为0.5 μg/ml、1.25 μg/ml、5.0 μg/ml的标准品各连续测定3次，计算峰面积（即浓度）的RSD值，如表1。中间精密度：在不同天由不同分析人员平行制备同重复性浓度相同的各3份标准品连续测定计算峰面积（即浓度）的RSD 值，如表2。根据中国药典（2015年版）9101药品质量标准分析方法验证指导原则，当样品浓度为1 μg/ml级别时，重复性RSD应≤8%，中间精密度RSD应≤16%[15]。从表1和表2可以看出，重复性RSD为0.096%～0.30%，日间精密度RSD为0.14%～0.52%，符合中国药典的相关要求。

表1 重复性试验结果（n=3）

表2 日间精密度试验结果 （n=3）

2.4 回收率

取加标浓度为0.55 μg/ml、0.80 μg/ml、1.55 μg/ml的样品各3份，分别测定3次，计算平均回收率，如表3。加标样品制备方法：取样品9份，向其中加入标准品，制备理论浓度为0.55 μg/ml、0.80 μg/ml、1.55 μg/ml的样品各3份。根据中国药典（2015年版）9101药品质量标准分析方法验证指导原则，当样品浓度为1 μg/ml级别时，回收率应符合80%～120%[15]。从表3可以看出，平均回收率为99.88%～103.33%，符合中国药典的相关要求。

表3 回收率试验结果（n=3）

2.5 样品MDI溶出量

空白供试液、供试液1、供试液2的MDA浓度及每套血液透析器MDI溶出量见表4，色谱图见图3。

计算过程如下：在浸提溶剂中，MDI转变为MDA，且是等浓度转变，因此，供试液中MDA的浓度即为MDI的浓度。MDI溶出量 M=（C供试液×2）×（500/50）=20C供试液。其中，M为每套血液透析器中MDI溶出量，单位为μg；C供试液为供试液MDA浓度，单位为μg/ml；2为复溶使用的乙腈体积，单位为ml；500为每套血液透析器制备的浸提液体积，单位为ml；50为旋转蒸干的浸提液体积，单位为ml。空白供试液1和空白供试液2未检出，因此，其MDA浓度均小于检出限，即为＜0.02 μg/ml。

表4 血液透析器中MDI溶出量结果

图3 MDA含量液相色谱图

3 讨论

因MDI在水中极易水解生成MDA，因此本研究以MDA为对象进行。美国毒物和疾病登记署（Agency for Toxic Substances and Disease Registry ，ATSDR）及美国国家卫生基金会（National Sanitation Foundation，NSF）评估了MDA的毒性，给出了短期每日安全剂量值，根据小鼠重复给药12周得到的最小安全剂量值为8.3 mg/（kg·d），采用不确定因子100（100=10×10，10为物种间差异，10为人体间差异），则人员短期每日安全剂量值为8.3/100=0.083 mg/（kg·d），即为可耐受摄入量TI值。

采用GB/T16886.17-2005《医疗器械生物学评价第17部分：可沥虑物允许限量的建立》中公式推导，可耐受限量TE=TI×m×UTF，UTF=CEF×PEF，PEF=nexp/nuse，则可耐受限量TE=TI×m×CEF×（nexp/nuse）。公式中：TI为耐受摄入量，0.083 mg/（kg·d）；m为医疗器械接触群体的体重，以体重70 kg计；CEF为多器械因子，缺省值为0.2；nexp为一种器械接触类别的天数，本产品最高接触6 h，0.25 d；nuse为器械的使用时间，本产品最高使用时间6 h，0.25 d。则 MDI的可耐受限量 TE=0.083×70×0.2×（0.25/0.25）=1.162 mg/次，因本产品为一次性使用，即可认为产品中MDI的最高溶出限量为1.162 mg/套。当流速分别为200 ml/min和400 ml/min时，每套血液透析器MDI含量分别为5.82 μg、5.98 μg，均在安全限量范围之内。

本研究建立了高效液相色谱仪检测血液透析器中MDI溶出量的分析方法，该方法具有处理简单、重复性好、定量准确等特点。同时，本研究进一步推导了血液透析器中MDI的安全限量值，可为使用聚氨酯密封胶密封血液透析器的医疗器械生产企业提供很好参考价值。