非结核分枝杆菌病实验室诊断方法分析及临床应用

陈 蕾，王凤平，徐俊驰，欧萌萌，方斌斌，吕 珏

(1．苏州市第五人民医院 检验中心，江苏 苏州215007；2.南京医科大学附属无锡精神卫生中心，江苏 无锡214002；3.无锡市第二人民医院,江苏 无锡214002)

非结核分枝杆菌(NTM)是分枝杆菌属内不包括MTB复合群和麻风分杆菌以外的其它分枝杆菌，到现在共发现154种NTM和13个亚种[1]，主要为腐物寄生菌，少部分对人体致病。可侵犯人体肺部、泌尿系统、淋巴结、皮肤及软组织等组织器官，可引起全身播散性感染。2012年非结核分枝杆菌病诊断与治疗专家共识指出，NTM病呈快速增多趋势，成为威胁人类健康的公共卫生问题。非结核分枝杆菌病临床表现、受累组织病理改变、胸部影像(X线/CT)与肺结核十分相似，临床将NTM感染误诊为结核病诊治屡见报道，且NTM对临床常用一、二线抗结核药天然耐药，造成久治不愈[2,3]。如何利用结核病实验诊断技术早期诊断非分枝杆菌病提诊断依据，特别是抗酸涂片阳性疑似肺结核患者减少误诊率。

1 材料与方法

1.1 研究对象及分组选择本院2013年11月-2016年3月诊治肺结核和非结核分枝杆菌感染患者共512例，其中确诊为非结核分枝杆菌病(NTM)患者194例，年龄20-87岁，平均年龄57岁，男女比例为1.85∶1.0；肺结核患者318例，年龄14-89岁，平均年龄43.5岁，男女比例为3.12∶1.0；健康对照组20例，年龄23-45岁，平均年龄35岁，男女比例为1.75∶1.0。NTM与肺结核诊断参考2012年非结核分枝杆菌病诊断与治疗专家共识及2013年中华医学会结核病分会制定《肺结核诊断和治疗指南》[4]，且细菌学分枝杆菌培养均为阳性病例。健康对照组为胸部X线无感染影像且无肺结核临床表现健康体检者。研究对象分组情况见表1。

表1 研究对象及分组情况

1.2 痰液标本检测方法研究对象按要求留取清晨痰液于痰液标本留置器内(含杀菌液)，取部分进行萋尔-尼尔逊涂片查抗酸杆菌，痰抗酸涂片按照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》要求操作。取部分痰液利用Bactec MGIT 960进行分枝杆菌培养，培养阳性样本行改良罗氏药敏及菌型鉴定；临床分离培养阳性株用于提取分枝杆菌DNA行PCR扩增检测，选用北京博奥生物有限公司结核分枝杆菌解决方案，包含检测仪器、结核分枝杆菌DNA检测试剂盒、菌种鉴定试剂盒。从分离株样本采集、核酸提取、PCR扩增、芯片杂交、芯片扫描及结果判读，均严格按照实验操作说明进行；以阴性、阳性质控品和阳性定量参考品的Ct值作为参考判定。比例法罗氏药物敏感试验每批均以结核分枝杆菌标准减毒株H37Ra(ATC25177)进行质控，所有实验操作均按照《结核病诊断实验室检验规程》、《江苏省临床基因扩增检验技术管理规范》要求进行，实验人员均具有中级以上职称并通过江苏省分子诊断实验技术培训。

1.3 血液标本检测方法疑似患者留取痰液标本后一周内采集血液标本，采集一管肝素锂抗凝鲜全血5 ml用并于2 h内送检，用于γ-干扰素体外释放试验(TB-IGRA)检测，另一管分离胶血清管用于结核抗体蛋白芯片检测。TB-IGRA检测使用北京万泰生物技术有限公司生产的γ-干扰素体外释放试验检测试剂盒，结核抗体蛋白芯片为南京大渊生物技术工程有限责任公司偍供的试剂盒，均严格按照说明书操作。

1.4 统计学方法收集资料用SPSS17.0软件进行统计学分析，应用灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值评估上述结核实验室检测方法的诊断效能，率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1痰抗酸涂片、TB-IGRA、结核蛋白芯片检测指标在194例非结核分枝杆菌病与318列肺结核患者阳性率比较结果见表2。其中痰抗酸涂片阳性率分别为56.1%、47.5%，结核蛋白芯片阳性率分别为64.9%、67.6%，非分枝杆菌病组和肺结核组痰涂片和结核蛋白芯片检测阳性率分析，两者显示无统计学意义(P>0.05)。TB-IGRA检测阳性率肺结核组达85.5%，非分枝杆菌病组19.6%，经统计学分析有显著性差异(P<0.01)。

表2 三种检测指标非分枝杆菌和肺结核组阳性率比较

2.2TB-IGRA检测指标在194例NTM和318例MTB检测灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值比较结果见表3。TB-IGRA检测指标在非分枝杆菌涂阳组敏感度最低(17.4%),阴性预测值(22.3%)；TB-IGRA检测指标在肺结核涂阳组敏感度最高(88.1%)，阴性预测值(51.3%)。

表3 TB-IGRA检测指标在NTM和MTB诊断效能结果

2.3选取临床分离培养238株分枝杆菌经改良罗氏培养菌种初步鉴定，其中结核分枝杆菌110株、牛结核分枝杆菌83株、非结核分枝杆菌45株。经DNA微阵列芯片法菌种鉴定结果，其中结核分枝杆菌复合群193株，45株非结核分枝杆菌包括胞内分枝杆菌29株，海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌1株，堪萨斯分枝杆菌12株，鸟分枝杆菌1株，偶然分枝杆菌2株。临床分离结核分枝杆菌复合群对常用抗结核耐药情况，链霉素耐药率最高达14%、异烟肼耐药率9.8%、利福平耐药率6.2%。分离到5种45株NTM主要是胞内和堪萨斯分枝杆菌，其对常用一线抗结核药物均显示高度耐药。见表4。

表4 临床分离培养238株分枝杆菌DNA微阵列芯片法菌种鉴定结果及抗结核耐药情况

3 讨论

非结核分枝杆菌(NTM)是除结核分枝杆菌复合群(MTB)和麻风分枝杆菌以外的其它分枝杆菌[5,6]。2012年中华医学会结核病学分会于非结核分枝杆菌病诊断与治疗专家共识指出，NTM病感染呈快速增多趋势，成为威胁人类健康的重要公共卫生问题[7]。利用结核病实验室技术提高对NTM病的诊断水平，减少NTM对健康的威胁。目前针对NTM病诊断具有呼吸系统临床表现，胸部影像学发现有空洞、多病灶支气扩张及小结节病变等，标本无污染条件下细菌学培养到NTM，才能确诊为NTM病[8,9]。细菌学培养周期长、阳性率不高，免疫学方法存在交叉反应，未筛选到灵敏度和特异度都高的诊断抗原，合理选择联合利用现有结核病实验技术是提高对NTM诊断早期诊断有效手段。

本研究从痰抗酸涂片、结核蛋白芯片、TB-IGRA检测指标在194例非结核分枝杆菌病(NTM)与318例肺结核病阳性率比较，痰抗酸涂片与结核蛋白芯片在两组疾病阳性率比较相近，经统计学分析两组间均无显著性差异(P>0.05)。2013年中华医学会结核病分会制定《肺结核诊断和治疗指南》，痰抗酸涂片只能证明抗酸杆菌存在，并不能区分是MTB还是NTM感染，存在敏感性低，但因方法操作简单、快速，适合基层实验室应用，作为肺结核筛查指标[10,11]。从我国历年结核病流行病学调查报告显示，非分枝杆菌分离率从1990年4.9%上升到2000年11.1%，2010年则高达22.2%，反应NTM病呈快速上升态势[12,13]。本院从2013年11月-2016年3月共分离到368例NTM株，阳性率达15.8%，NTM培养阳性率呈上升趋势，与文献报道相一致。结核蛋白芯片技术作为简便快速诊断结核病方法，检测人血清中特异性脂阿拉伯甘露糖抗原(LAM)、抗原38 kD、16 kD抗体诊断结核病[14]。从表2可见结核蛋白芯片在诊断肺结核有一定临床价值，但其在非结核分枝杆菌感染时同样出现较高阳性反应，NTM和MTB两组阳性率经卡方检验无显著性差异(P>0.05)。分析原因可能所检测三种结核特异抗原在非分枝杆菌感染出现交叉免疫，敏感度与特异性欠佳，对于阳性结果临床应综合分析。

TB-IGRA检测结核分枝杆菌ESAT-6、CFP-10为抗原剌激机体产生特异性γ-干扰素，在诊断结核病特别是肺外结核有较高灵敏度。从表3可见，TB-IGRA检测在肺结核涂阳和涂阳组均有较高灵敏度(88.1%、83.2%)可作为肺结核病早期筛查重要指标，与王宗义等报道一致[15]。而TB-IGRA检测指标在NTM组灵敏度不到20%，且有较好的阴性预测值，提示TB-IGRA指标在鉴别诊断NTM和MTB有良好应用价值。回顾分析194例NTM病患者发现，由于NTM和MTB在临床表现、实验室诊断技术、影像学表现、组织病理等表现极为相似，若无菌型鉴定结果易误诊为肺结核。本文病例高达80%NTM病例初诊为肺结核入院，并予以抗结核治疗，造成治疗效果差、周期长，并出现药物性肝肾功能损害、白细胞数量下降等不良反应。本文实验对疑似患者痰液样本利用Bactec MGIT 960进行分枝杆菌培养，培养阳性液体样本均经抗酸染色证实，随后进行改良罗氏药敏及菌型初步鉴定。根据鉴别培养管上分枝杆菌生长情况，如两种鉴别培养管中培养基上无分枝杆菌生长，则为牛结核分枝杆菌；如两种鉴别培养管中培养基上生长，则为非结核分枝杆菌菌群；如对硝基苯甲酸(PNB)培养基上分枝杆菌不生长而噻吩2-羧酸肼(TCH)培养基上有分枝杆菌生长，则报告为结核分枝杆菌。临床疑似患者利用Bactec MGIT 960结核分枝杆菌培养阳性液体分离株进行分枝杆菌菌种鉴定(DNA微阵列芯片法)。结核分枝杆菌DNA微阵列芯片法针对临床常见分枝杆菌设计特异性PCR扩增引物以及种属特异性寡核苷酸片段探针。以临床分离的致病菌株DNA为模板，运用独特不对称PCR技术扩增，引物末端标记荧光分子，扩增过程中待检DNA分子被扩增并带有荧光标记DNA片段。将带有荧光标记PCR扩增产物与微阵列芯片探针进行杂交反应，分枝杆菌种属特异性寡核苷酸探针与序列匹配的PCR扩增产物形成稳定二级结构。采用基因芯片微量点样技术，探针在芯片特定位置排列，推断出相应被测细菌DNA相关信息，鉴定出细菌的种类[16]。本文实验使用博奥生物晶芯分枝杆菌菌种鉴定试剂，可检测包括临床常见分枝杆菌的17个种或群。从表4中可见，临床分离培养238例分枝杆菌利用微阵列芯片技术进行菌种鉴定，其中193株为结核分枝杆菌复合群，其中3种一线抗结核药耐药率大于5%。45株NTM菌种鉴定包括5种NTM，其中胞内分枝杆菌29株(64.4%)、堪萨斯分枝杆菌12株(26.7%)、偶然分枝杆菌2株、海分枝杆菌-溃疡分枝杆菌和鸟分枝杆菌各1株,5种NTM对临床常用一线抗结核药物均显示高度耐药，与盛青等报道相一致[17]。临床病例误诊误治极易造成患者病程迁延，肺内病灶纤维增殖，使得NTM治疗周期更久。而TB-IGRA检测指标在NTM组有较好阴性预测值，在临床诊疗中对于TB-IGRA检测阴性疑似肺结核患者，应尽早多次进行分枝杆菌培养或有条件进行支气管活检组织和灌洗液培养，以提供细菌学确诊依据。在细菌学分枝杆菌培养结果未报告前，考虑到临床疗效不确切，治疗费用和抗结核药物不良反应，临床医生可对于症状轻微患者，不进行早期抗结核治疗。

本研究发现痰抗酸涂片、结核蛋白芯片在早期筛查肺结核病时有一定临床应用价值，但其在NTM和MTB感染均可显示阳性反应，对疑似NTM感染患者无法鉴别诊断。TB-IGRA检测在NTM组有较好的阴性预测值，可作为NTM和MTB鉴别诊断指标，尤其是痰抗酸涂片阳性而TB-IGRA检测阴性疑似肺结核患者，应充分考虑NTM感染，给临床提供早期诊断依据。