急性坏死性胰腺炎大鼠腹腔巨噬细胞胱天蛋白酶募集域蛋白9、Toll样受体4的作用机制

何阳寰 徐萍 杨志文 田军

南京医科大学附属上海松江中心医院消化内科，上海 201600

【提要】 提取急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠腹腔巨噬细胞体外培养，通过携带靶向胱天蛋白酶募集域蛋白9(CARD9)的腺病毒感染巨噬细胞后，细胞TLR4、CARD9、NF-κB、p38MAPK基因表达均下降(P值均<0.05)，多聚肌苷酸盐P4154干预可上调TLR4基因表达，进而上调CARD9、NF-κB、p38 MAPK基因的表达(P值均<0.05)，提示ANP大鼠腹腔巨噬细胞存在TLR4/CARD9/NF-κB(p38MAPK)信号途径。

急性胰腺炎(AP)是一种炎症性疾病，尽管严重程度各不相同，但腺泡损伤都与胰腺早期炎症反应相关，其特征是巨噬细胞激活，分泌多种细胞因子[1]。选择性清除腹腔巨噬细胞可减少早期细胞因子的来源，降低细胞因子的级联放大效应，将炎症反应控制在胰腺局部，减轻全身的炎症反应，从而改善患者预后[2]。胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain-containing protein 9，CARD9)是在树突细胞和先天骨髓细胞的巨噬细胞内高度表达的一种免疫炎症蛋白[3]，可激活NF-κB、p38MAPK等炎症反应信号通路，参与多种感染性炎症反应[4]。本课题组前期研究结果显示，重症AP(SAP)患者外周血单核细胞CARD9的表达升高，且与NF-κB、p38MAPK蛋白磷酸化水平呈正相关[5-7]，通过携带靶向CARD9的siRNA腺病毒(siR-CARD9)感染可阻断NF-κB和p38MAPK的激活，减轻胰腺组织的炎症反应[8]。本研究通过siR-CARD9感染腹水巨噬细胞，探讨CARD9基因对急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠腹水巨噬细胞的作用机制。

一、材料与方法

1．腹水巨噬细胞的分离、纯化及分组：60只健康雄性Sprague Dawley大鼠，鼠龄2～2.5个月，SPF级， 体重240～260 g， 由上海捷思杰实验动物公司提供和饲养，动物合格证号SCXK(沪)2013-0006。采用胆胰管逆行注射50 g/L牛磺胆酸钠1 ml/kg体重方法制备大鼠ANP模型[9]，共48只。其余12只正常喂养，作为对照组。造模后3、6 h在无菌环境下抽取腹水，并以25 ml预冷PBS行腹腔灌洗2次，对照组直接行腹腔灌洗。将腹腔灌洗液及腹水混合均匀，以密度梯度离心法分离腹水巨噬细胞，以DMEM完全培养液(含10% FBS)吹打混匀沉淀细胞，均匀种植于12孔培养板，置37℃、5% CO2培养箱中孵育。

将巨噬细胞分为对照组(6只大鼠的纯化量)，ANP 3、6 h组(各6只量)，ANP 3 h+siR-CARD9、ANP 6 h+siR-CARD9组(各6只量)，ANP 3 h+腺病毒、ANP 6 h+腺病毒组(各6只量)，多聚肌苷酸盐P4154对照组(Poly组，6只量 )，ANP 3h+Poly组和ANP 3h+siR-CARD9+Poly组(各6只量)。siR-CARD9腺病毒委托和元生物技术(上海)有限公司构建、鉴定，病毒原液为1×1011/ml。巨噬细胞培养6 h后按MOI为1∶200(通过预实验获得的最佳MOI)的病毒量置无血清培养液中感染巨噬细胞3 h，弃上清，换成含5%血清的培养液继续培养24 h[10]，倒置荧光显微镜下(400倍)随机选取6个视野(至少100个细胞)进行细胞计数。

多聚肌苷酸盐P4154购自美国SIGMA公司。巨噬细胞培养6 h后加入含血清的培养液继续培养3 h，弃上清，加入终浓度为20 μg/ml的多聚肌苷酸再继续培养24 h[11]，倒置荧光显微镜下(400倍)随机选取6个视野(至少100个细胞)进行细胞计数。

2．腹水巨噬细胞CARD9、NF-κB、Toll样受体4(TLR4)mRNA表达检测：用Trizol(美国Invitrogen公司)提取腹腔巨噬细胞总RNA，用逆转录试剂盒(日本Takara公司)将总RNA反转录成cDNA。采用实时荧光定量PCR法检测CARD9、NF-κB、TLR4 mRNA表达，以GAPDH作为内参。CARD9 上游引物5′-ATTGACCCCTCACGAATCAC-3′，下游引物5′-AGGAGCACACCCACTTTCC-3′；NF-κB上游引物5′-CCTGTCTGAAGCCCTGCTAC-3′，下游引物5′-TGCCAGGTCTGTGAACACTC-3′；p38上游引物5′-ATGACGAAATGACCGGCTAC-3′，下游引物5′-CCACGGACCAAATATCCACT-3′； 内参GAPDH上游引物5′-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物5′-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成。PCR反应条件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 45 s，40个循环。以2-ΔΔCT计算目的基因mRNA的相对表达量。

3．腹腔巨噬细胞CARD9、p65、p-p65、p38、p-p38MAPK、TLR4蛋白表达检测：应用蛋白裂解液提取腹腔巨噬细胞，蛋白定量后采用常规蛋白质印迹法检测腹腔巨噬细胞CARD9、p65、p-p65、p38、p-p38MAPK、TLR4蛋白表达量。

4．细胞培养上清TNF-α、IL-1β、IL-6水平检测：取各组大鼠腹水巨噬细胞培养上清，采用ELASA法检测上清液TNF-α、IL-1β、IL-6水平。试剂盒购自美国eBioScience公司，按说明书操作。

二、结果

1．各组大鼠腹腔巨噬细胞CARD9 mRNA及蛋白表达变化：ANP大鼠腹腔巨噬细胞CARD9 mRNA及蛋白表达量随时间延长而升高，与对照组的差异均有统计学意义(t3h=10.20、t6h=6.93；t3h=-7.17、t6h=-6.56，P值均<0.05)。siR-CARD9腺病毒感染后ANP大鼠腹腔巨噬细胞CARD9 mRNA表达量较ANP组显著下降，差异有统计学意义(t3h=-7.17、t6h=-6.56；t3h=-14.68、t6h=-11.44，P值均<0.05)，而空载腺病毒感染后巨噬细胞CARD9 mRNA及蛋白表达量与ANP组的差异无统计学意义。多聚肌苷酸盐P4154干预后巨噬细胞CARD9 mRNA及蛋白表达量较对照组显著升高，差异有统计学意义(t=8.79、14.55，P值均<0.01)，但与ANP组差异无统计学意义；若siR-CARD9腺病毒加P4154共同干预ANP大鼠腹腔巨噬细胞，则CARD9 mRNA 及蛋白表达量显著下降，差异有统计学意义(t=-9.22、-6.92，P值均<0.05，表1)。

组别只数CARD9 mRNACARD 9蛋白对照组61.00±0.011.00±0.01ANP 3 h组616.57±3.74a4.31±0.38bANP 6 h组633.63±11.54b9.65±1.14aANP 3 h+siR-CARD9组63.48±2.46d1.38±0.11dANP 6 h+siR-CARD9组62.28±1.98c1.74±0.77dANP 3 h+腺病毒组624.35±19.01b4.34±2.35bANP 6 h+腺病毒组627.89±24.40b8.50±2.37bPoly组68.07±1.97b77.66±5.79bANP 3 h+Poly组610.20±2.31b76.82±4.79bANP 3 h+Poly+siR-CARD9组61.42±0.29d37.98±5.14d

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与ANP组比较，cP<0.05，dP<0.01

2．各组巨噬细胞TLR4、NF-κB、p38MAPK mRNA及蛋白表达的变化：ANP大鼠腹腔巨噬细胞TLR4、NF-κB、p38MAPK mRNA及蛋白表达量随时间延长而升高，与对照组的差异均有统计学意义(tNF-κBmRNA=7.64、6.15，tp38MAPKmRNA=9.50、3.24，tTLR4 mRNA=6.29、6.23，P值均<0.05；tTLR4protein=3.61、19.02，tNF-κBprotein=14.21、12.36，tp38MAPKprotein=42.65、84.03，P值均<0.05)。siR-CARD9腺病毒感染后ANP大鼠腹腔巨噬细胞CARD9 mRNA表达量较ANP组显著下降，差异有统计学意义(t3h=-7.17、t6h=-6.56，P<0.05)，而空载腺病毒感染后巨噬细胞CARD9 mRNA及蛋白表达量与ANP组的差异无统计学意义。多聚肌苷酸盐P4154干预后巨噬细胞CARD9 mRNA 及蛋白表达量较对照组显著升高，差异有统计学意义(t=8.79、16.26，P值均<0.01)，但与ANP组的差异无统计学意义；若siR-CARD9腺病毒加P4154共同干预ANP大鼠腹腔巨噬细胞，则CARD9 mRNA及蛋白表达量显著下降，差异有统计学意义(t=-9.22、-9.57，P值均<0.01，表2)。

3．各组大鼠腹腔巨噬细胞培养上清TNF-α、IL-1β和IL-6水平的变化：ANP组腹腔巨噬细胞培养上清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均较对照组显著升高，差异有统计学意义(tTNF-α=8.67、8.25，tIL-β=3.96、8.92，tIL-6=3.90、13.29，P值均<0.05)。siR-CARD9腺病毒感染后ANP大鼠腹腔巨噬细胞培养上清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均较ANP组显著下降，差异有统计学意义(tTNF-α=-4.59、-5.17，tIL-β=-5.33、-6.80，tIL-6=-7.35、-8.95，P值均<0.05)，而空载腺病毒感染后巨噬细胞培养上清TNF-α、IL-1β、IL-6水平与ANP组的差异无统计学意义(表3)。

表2 各组巨噬细胞TLR4、NF-κB、p38MAPK mRNA及蛋白表达的变化

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与ANP组比较，cP<0.05，dP<0.01

表3 各组巨噬细胞培养上清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与ANP组比较，cP<0.05，dP<0.01

讨论巨噬细胞激活是SAP过程中的早期事件，受伤的胰腺作为炎症刺激物激活巨噬细胞和其他炎症细胞释放TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、PAF、NO等细胞因子，细胞因子又通过级联反应放大产生协同效应，最终导致病情加重[12]。

CARD9是适配子分子，其含有对蛋白质寡聚化重要的N-端半胱天冬酶-募集结构域(CARD)和C-末端卷曲螺旋结构域。 CARD9位于染色体9q34.3上，其cDNA 2 108 bp长编码536个氨基酸的蛋白质，预测分子量为62 3000[13]，它能在巨噬细胞内与Bc110、Maltl结合，形成CARD9/Bcl10/Maltl复合体(CBM复合体)，进而激活NF-κB、p38MAPK信号通路[14-16]。

Toll样受体(TLRs)介导环境刺激和先天免疫之间的相互作用。TLR4不仅在免疫细胞中表达，而且在胰腺导管、内皮细胞和巨噬细胞中表达。牛黄胆酸盐引起的胰腺腺泡细胞坏死、水肿和出血在TLR4-/-小鼠中显著降低[17]。TLR4在炎症疾病中可通过丝氨酸-苏氨酸激酶激活CARD9-Bcl-10-MALT1复合体从而激活NF-κB、p38MAPK通路，进而调控下游炎性因子的表达[18]，也可以不通过CARD9复合体激活NF-κB通路。

本课题组前期研究[19]结果显示，SAP患者外周血单核细胞的NF-κB、p38MAPK信号通路被激活。本研究结果显示，ANP大鼠腹腔巨噬细胞CARD9 mRNA表达随时间增加而逐渐升高，同时TLR4、NF-κB、p38MAPK mRNA及蛋白的表达上调，外周血中TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎细胞因子水平显著升高。应用携带靶向CARD9的腺病毒感染后，腹腔巨噬细胞的CARD9表达被抑制，同时TLR4 mRNA及蛋白表达下调，NF-κB、p38MAPK NF-κB、p38MAPK磷酸化水平下降 ，细胞培养上清TNF-α、IL-1β和IL-6水平下降，提示CARD9基因能激活NF-κB和p38MAPK信号通路，释放大量促炎细胞因子，使局部炎症反应向全身扩散。

本研究结果还显示，应用多聚肌苷酸干预后，腹腔巨噬细胞TLR4及CARD9基因表达上调，同时细胞培养上清TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达升高。加上携带靶向CARD9腺病毒感染后腹腔巨噬细胞CARD9、TLR4基因表达下调，培养上清TNF-α、IL-1β和IL-6 水平明显降低，进一步提示TLR4是CARD9信号通路中的上游信号分子。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突