柴芍口服液中芍药苷含量的高效液相色谱法测定

张会梅 孙亚磊 王艳玲 钟英杰 魏秀丽 付海宁 栾明娜 庞云露 蒋贻海 徐恩民

摘要：采用高效液相法对柴芍口服液指标性成分芍药苷含量进行测定。色谱柱：ZorbaxSBC18（4.6mm×250mm，5μm）;流动相：乙腈+0.05%磷酸溶液（14∶86）;流速：1.0mL/min;柱温：35℃;检测波长：230nm。经精密度、稳定性、重复性、回收率等验证，在该色谱条件下能够达到对柴芍口服液的质量控制。

关键词：柴芍口服液;高效液相色谱;芍药苷

中图分类号：S815.4文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）05-0144-04

本研究中的新中兽药柴芍口服液由柴胡、白芍、枳实、甘草4味中药组方，经提取制备而成，具有透解郁热、调和肝脾的功效，主治由霉菌毒素导致的鸡肝损伤。柴胡的主要有效成分为五环三萜类柴胡皂苷a-f和挥发油，具有镇静、解热镇痛、抗炎和免疫调节等功能[1];白芍中含有丰富的单萜苷类化合物，以芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷和氧芍药苷等为主，具有多途径抑制自身免疫反应，以及抗炎、止痛、保肝等多种药理作用[2];枳实主要含有黄酮类、生物碱类、挥发油类等成分，具有调节肠胃运动、调节子宫功能、升压、强心、抗氧化、抗菌、镇痛、抗血栓等药理作用[3];甘草的活性成分是三萜皂苷和黄酮类化合物，具有抗溃疡、抗炎、解痉、抗氧化、抗病毒、抗癌、抗抑郁、保肝、祛痰和增强记忆力等多种药理活性。芍药苷为柴芍口服液中的重要有效成分。参照文献[4]，本试验采用高效液相色谱法对本品中芍药苷含量进行检测，并提供方法学研究资料。

1材料与方法

1.1药品及对照品

柴芍口服液（批号：20180601），潍坊诺达药业生产。

芍药苷：中国食品药品检定研究院，纯度96.4%，批号：110736-201438。

1.2仪器与试剂

Agilent1260高效液相色谱仪（G1311C四元泵，G1329B自动进样仪，G1316A柱温箱，G4212B二极管阵列检测器，Agilent化学工作站）;Agilent1200高效液相色谱仪（G1322A脱气机，G1311A四元泵，G1329A自动进样仪，G1315D二极管阵列检测器，Agilent化学工作站）。

AS20500B型超聲波清洗仪：天津AutoScienceCo.Ltd.;DHG-9101.2S型电热恒温鼓风干燥箱：上海三发科学仪器公司;数显恒温水浴锅DK-S2.4：上海三发科学仪器公司;BT125D型电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

试剂：甲醇（色谱纯）：MercKKGaA;乙腈（色谱纯）：美国Tedia天地试剂公司;磷酸为国产分析纯。

1.3方法

1.3.1色谱条件

色谱柱：ZorbaxSBC18（4.6mm×250mm，5μm）;流动相：乙腈-0.05%磷酸溶液（14∶86）;流速：1.0mL/min;柱温：35℃;检测波长：230nm;进样量10μL。液相色谱梯度洗脱见表1。

1.3.2样品及对照品溶液的制备

对照品溶液的制备：精密称取芍药苷对照品适量，加14%乙腈制成80μg/mL的溶液，即得。

供试品溶液的制备：精密量取本品1mL，置50mL量瓶中，用14%乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2结果与分析

2.1系统适应性试验

取试验药品（批号：20180601），按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按建立的色谱条件进样分析6次，记录色谱图。结果（表2）：理论板数n>3000，芍药苷与最邻近峰的分离度R>1.5，试验系统可靠有效。

2.2专属性试验

按照样品的制备方法，制备缺失芍药苷的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液，分别精密吸取阴性对照溶液与芍药苷标准品溶液各10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。结果：阴性样品的图谱中（图1），在与供试品图谱中芍药苷（图2）的色谱峰位置上（Rt=12.756）无干扰，说明本方法测定芍药苷专属性良好。

2.3线性关系考察

精密称定20.24mg芍药苷，置50mL量瓶中，加入14%乙腈溶液，溶解后稀释定容至刻度，得含芍药苷401.76μg/mL的对照品贮备液。精密量取对照品贮备液适量，用14%乙腈稀释，得分别含芍药苷16.07、40.18、80.35、160.70、200.88、401.76μg/mL的系列对照品溶液。

按建立的色谱条件进行分析，记录色谱图与峰面积，结果见表3。以芍药苷峰面积为纵坐标，芍药苷的浓度（μg/mL）为横坐标，进行线性回归，得芍药苷标准曲线（n=6）（图3）。回归方程：y=12.465x+21.147，R2=0.9997。表明芍药苷含量在16.07～401.76μg/mL范围内线性关系良好。

2.4精密度试验

按供试品溶液制备方法，制备批号20180601的供试品溶液。按建立的色谱条件重复进样6次，记录色谱图，计算峰面积值，结果见表4。按芍药苷峰面积计算RSD值等于0.87%（n=6），说明仪器的精密度良好。

2.5稳定性试验

取同一批号样品（批号：20180601），按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件分别于0、2、4、6、8、12h进样分析，记录色谱图，计算峰面积值，结果见表5。按芍药苷峰面积计算RSD等于0.37%（n=6），说明样品溶液在12h内稳定。

2.6重复性试验

取同一批号样品（批号：20180601），按供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件进样分析，记录色谱图，根据峰面积值计算芍药苷含量，结果见表6。按芍药苷含量计算RSD等于0.43%（n=6），说明方法重复性良好。

2.7回收率试验

精密量取已知含量的同一批号样品（批号：20180601）0.5mL共6份，分别置于50mL的容量瓶中，分别加入25mL芍药苷对照品储备溶液（90.89μg/mL），加入14%乙腈定容至刻度，按供试品溶液制备方法制备供试品，经0.45μm微孔滤膜滤过后，吸取10μL进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。结果见表7：芍药苷的平均回收率为101.81%，RSD为0.73%（n=6）。

2.8耐用性试验

取同一批号样品（批号：20180601），按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别考察流动相比例变化（±2%）、柱温变化（±5℃）、流速相对值变化（±20%）、同一类型不同厂牌色谱柱对样品色谱行为的影响，记录色谱图。观察芍药苷峰和临近峰的基线分离情况，并计算各条件下芍药苷含量的相对标准偏差。结果见表8：在各条件下，芍药苷峰与临近峰达到基线分离。并且在流动相比例、柱温有小的变动、换用同一类型不同厂牌色谱柱时，均不影响含量测定结果。

3结论

柴芍口服液是由四逆散经过提取而制成的制剂。在含量测定部分，以柴芍口服液中的芍药苷为指标成分，通过色谱条件的优化，建立了理论塔板数高、分离度好的色谱条件。经过精密度、稳定性、重复性考察及加样回收率试验等方法学验证，该方法具有较高的准确性和重现性，能够达到对新中兽药柴芍口服液中芍药苷的含量检测要求。

参考文献：

[1]谢东浩，蔡宝昌，安益强，等.柴胡皂苷类化学成分及药理作用研究进展[J].南京中医药大学学报，2007，23（1）：63-65.

[2]高小荣，田庚元.白芍化学成分研究进展[J].中国新药杂志，2006，15（6）：416-418.

[3]张红，孙明江，王凌.枳实的化学成分及药理作用研究进展[J].中药材，2009，32（11）：1787-1790.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].2015版.北京：中国医药科技出版社，267，786.